ურსა მონოამიდების აღმოჩენა, დახასიათება და ფუნქციური გაუმჯობესება, როგორც მცენარეთა ზრდის ახალი ინჰიბიტორები, რომლებიც გავლენას ახდენენ მცენარეთა მიკროტუბულებზე.

გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის.ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა.საუკეთესო შედეგისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ თქვენი ბრაუზერის უფრო ახალი ვერსია (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში).იმავდროულად, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის ან JavaScript-ის გარეშე.
ნატურალური პროდუქტების აღმოჩენა და სასარგებლო გამოყენება ხელს შეუწყობს ადამიანის ცხოვრების გაუმჯობესებას.მცენარეთა ზრდის შემაფერხებელი ქიმიკატები ფართოდ გამოიყენება როგორც ჰერბიციდები სარეველების გასაკონტროლებლად.სხვადასხვა ტიპის ჰერბიციდების გამოყენების აუცილებლობის გამო, საჭიროა ნაერთების იდენტიფიცირება მოქმედების ახალი მექანიზმებით.ამ კვლევაში ჩვენ აღმოვაჩინეთ ახალი N-ალკოქსიპიროლი ნაერთი, კუმამონამიდი, Streptomyces werraensis MK493-CF1-დან და დავადგინეთ სრული სინთეზის პროცესი.ბიოლოგიური აქტივობის ანალიზის მეშვეობით ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ურს-მონოამიდის მჟავა არის ურს-მონოამიდის სინთეზური შუალედური და პოტენციალი.მცენარეთა ზრდის ინჰიბიტორი.გარდა ამისა, ჩვენ შევიმუშავეთ სხვადასხვა ურბენონის მჟავას წარმოებულები, მათ შორის ურბენილოქსი წარმოებული (UDA), რომელსაც აქვს მაღალი ჰერბიციდური აქტივობა HeLa უჯრედების ზრდაზე ნეგატიური ზემოქმედების გარეშე.ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ურმოტონური მჟავას წარმოებულები არღვევენ მცენარის მიკროტუბულებს;გარდა ამისა, KAND მოქმედებს აქტინის ძაფებზე და იწვევს უჯრედების სიკვდილს;ეს მრავალმხრივი ეფექტები განსხვავდება ცნობილი მიკროტუბულების ინჰიბიტორებისგან და გვთავაზობს ურსონის მჟავას მოქმედების ახალ მექანიზმს, რაც წარმოადგენს მნიშვნელოვან უპირატესობას ახალი ჰერბიციდების შემუშავებაში.
სასარგებლო ბუნებრივი პროდუქტებისა და მათი წარმოებულების აღმოჩენა და პრაქტიკული გამოყენება არის ადამიანის ცხოვრების ხარისხის გაუმჯობესების საშუალება.მიკროორგანიზმების, მცენარეებისა და მწერების მიერ წარმოქმნილმა მეორად მეტაბოლიტებმა გამოიწვია მნიშვნელოვანი წინსვლა მედიცინასა და სოფლის მეურნეობაში.ბევრი ანტიბიოტიკი და ლეიკემიის საწინააღმდეგო პრეპარატი შემუშავებულია ბუნებრივი პროდუქტებისგან.გარდა ამისა, სხვადასხვა სახისპესტიციდები, ფუნგიციდები და ჰერბიციდები მიიღება ამ ბუნებრივი პროდუქტებიდან სოფლის მეურნეობაში გამოსაყენებლად.კერძოდ, სარეველების საწინააღმდეგო ჰერბიციდები თანამედროვე სოფლის მეურნეობაში მოსავლის მოსავლიანობის გაზრდის მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტია და სხვადასხვა სახის ნაერთები უკვე გამოიყენება კომერციულად.მცენარეებში რამდენიმე ფიჭური პროცესი, როგორიცაა ფოტოსინთეზი, ამინომჟავების მეტაბოლიზმი, უჯრედის კედლის სინთეზი, მიტოზის რეგულირება, ფიტოჰორმონის სიგნალიზაცია ან ცილის სინთეზი, ითვლება ჰერბიციდების ტიპურ სამიზნეებად.ნაერთები, რომლებიც აფერხებენ მიკროტუბულების ფუნქციას, არის ჰერბიციდების საერთო კლასი, რომლებიც გავლენას ახდენენ მცენარეთა ზრდაზე მიტოზურ რეგულაციაზე ზემოქმედებით2.
მიკროტუბულები ციტოჩონჩხის კომპონენტებია და ფართოდ არის დაცული ევკარიოტულ უჯრედებში.ტუბულინის ჰეტეროდიმერი შედგება α-ტუბულინის და β-ტუბულინის ფორმირების ხაზოვანი მიკროტუბულური პროტოფილამენტებისგან, 13 პროტოფილამენტით, რომლებიც ქმნიან ცილინდრულ სტრუქტურას.მიკროტუბულები მრავალ როლს ასრულებენ მცენარეთა უჯრედებში, მათ შორის უჯრედის ფორმის, უჯრედების გაყოფის და უჯრედშიდა ტრანსპორტის განსაზღვრაში3,4.მცენარეთა უჯრედები შეიცავენ მიკროტუბულებს ინტერფაზური პლაზმური მემბრანის ქვეშ და ეს ეგრეთ წოდებული კორტიკალური მიკროტუბულები აკონტროლებენ ცელულოზის მიკროფიბრილების ორგანიზაციას ცელულოზის სინთაზას კომპლექსების რეგულირების გზით4,5.ფესვის ეპიდერმული უჯრედების კორტიკალური მიკროტუბულები, რომლებიც იმყოფება ფესვის წვერის სწრაფი გახანგრძლივების ზონაში, განლაგებულია ლატერალურად, ხოლო ცელულოზის მიკრობოჭკოები მიჰყვებიან ამ მიკროტუბულებს და ზღუდავენ უჯრედების გაფართოების მიმართულებას, რითაც ხელს უწყობს უჯრედის ანიზოტროპულ გახანგრძლივებას.ამიტომ მიკროტუბულების ფუნქცია მჭიდროდ არის დაკავშირებული მცენარის მორფოლოგიასთან.ამინომჟავების ჩანაცვლება ტუბულინის მაკოდირებელ გენებში იწვევს კორტიკალური მიკროტუბულური მასივების დახრილობას და მარცხენა ან მარჯვენა მხარეს ზრდას Arabidopsis 6,7-ში.ანალოგიურად, მიკროტუბულებთან ასოცირებულ პროტეინებში მუტაციებმა, რომლებიც არეგულირებენ მიკროტუბულების დინამიკას, ასევე შეიძლება გამოიწვიოს ფესვების ზრდის დამახინჯება8,9,10,11,12,13.გარდა ამისა, მიკროტუბულების დამრღვევი ჰერბიციდებით, როგორიცაა დიზოპირამიდი, ასევე ცნობილი როგორც პრეტილაქლორი, ასევე იწვევს ფესვის მარცხენა ირიბი ზრდას14.ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ მიკროტუბულების ფუნქციის ზუსტი რეგულირება გადამწყვეტია მცენარის ზრდის მიმართულების დასადგენად.
აღმოჩენილია მიკროტუბულური ინჰიბიტორების სხვადასხვა სახეობა და ამ პრეპარატებმა მნიშვნელოვანი წვლილი შეიტანეს ციტოჩონჩხის კვლევაში, ასევე სოფლის მეურნეობასა და მედიცინაში2.კერძოდ, ორიზალინს, დინიტროანილინის ნაერთებს, დიზოპირამიდს, ბენზამიდთან დაკავშირებულ ნაერთებს და მათ ანალოგებს შეუძლიათ მიკროტუბულების ფუნქციის დათრგუნვა და ამით მცენარის ზრდის შეფერხება.ამიტომ, ისინი ფართოდ გამოიყენება როგორც ჰერბიციდები.თუმცა, ვინაიდან მიკროტუბულები მცენარეული და ცხოველური უჯრედების მნიშვნელოვანი კომპონენტია, მიკროტუბულების ინჰიბიტორების უმეტესობა ციტოტოქსიურია ორივე ტიპის უჯრედისთვის.ამიტომ, ჰერბიციდების სახით მათი აღიარებული სარგებლობის მიუხედავად, ანტიმიკროტუბულური აგენტების შეზღუდული რაოდენობა გამოიყენება პრაქტიკული მიზნებისთვის.
Streptomyces არის Streptomyces ოჯახის გვარი, რომელიც მოიცავს აერობულ, გრამდადებით, ძაფისებრ ბაქტერიებს და ფართოდ არის ცნობილი მეორადი მეტაბოლიტების ფართო სპექტრის გამომუშავების უნარით.ამიტომ, იგი ითვლება ახალი ბიოლოგიურად აქტიური ბუნებრივი პროდუქტების ერთ-ერთ ყველაზე მნიშვნელოვან წყაროდ.მიმდინარე კვლევაში ჩვენ აღმოვაჩინეთ ახალი ნაერთი, სახელად კუმამონამიდი, რომელიც იზოლირებული იყო Streptomyces werraensis MK493-CF1 და S. werraensis ISP 5486. სპექტრალური ანალიზისა და სრული სპექტრალური ანალიზის გამოყენებით, კუმამონამიდის სტრუქტურა დახასიათდა მისი უნიკალური N-ალკოქსიპიროლის ჩონჩხი. განისაზღვრა.სინთეზი.აღმოჩნდა, რომ ურსმონის მჟავა, ურსმონოამიდისა და მისი წარმოებულების სინთეზური შუამავალი, აფერხებს პოპულარული მოდელი მცენარის Arabidopsis thaliana ზრდას და აღმოცენებას.სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის კვლევაში, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ნაერთი C9-ით მოდიფიცირებული ურსონის მჟავად, რომელსაც ეწოდება ურსონის მჟავას არაილოქსიური წარმოებული (KAND), მნიშვნელოვნად აძლიერებს ინჰიბიტორულ ეფექტს ზრდასა და აღმოცენებაზე.აღსანიშნავია, რომ ახლად აღმოჩენილი მცენარის ზრდის ინჰიბიტორი ასევე გავლენას ახდენდა თამბაქოს და ღვიძლის წიაღის ზრდაზე და არ იყო ციტოტოქსიკური ბაქტერიების ან HeLa უჯრედებისთვის.უფრო მეტიც, ზოგიერთი ურმოტონური მჟავის წარმოებულები იწვევს ფესვის დამახინჯებულ ფენოტიპს, რაც გულისხმობს, რომ ეს წარმოებულები პირდაპირ ან ირიბად გავლენას ახდენენ მიკროტუბულებზე.ამ იდეის შესაბამისად, ჩვენი დაკვირვება მიკროტუბულებზე, რომლებიც ეტიკეტირებულია ან იმუნოჰისტოქიმიურად ან ფლუორესცენტური პროტეინებით, მიუთითებს იმაზე, რომ KAND მკურნალობა ახდენს მიკროტუბულების დეპოლიმერიზაციას.გარდა ამისა, კუმამოტონური მჟავის წარმოებულებით მკურნალობამ დაარღვია აქტინის მიკროფილამენტები.ამრიგად, ჩვენ აღმოვაჩინეთ მცენარის ზრდის ახალი ინჰიბიტორი, რომლის მოქმედების უნიკალური მექანიზმი ციტოჩონჩხის განადგურებას გულისხმობს.
შტამი MK493-CF1 იზოლირებული იქნა ნიადაგიდან შინაგავა-კუში, ტოკიო.შტამმა MK493-CF1 წარმოადგინა კარგად განშტოებული სტრომული მიცელიუმი.განისაზღვრა 16S რიბოსომური რნმ გენის ნაწილობრივი თანმიმდევრობა (1422 bp).ეს შტამი ძალიან ჰგავს S. werraensis-ს (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ტიპიური შტამი, 99.93%).ამ შედეგის საფუძველზე დადგინდა, რომ ეს შტამი მჭიდროდ იყო დაკავშირებული S. werraensis-ის ტიპთან.ამიტომ, ჩვენ დროებით დავარქვით ამ შტამს S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T ასევე აწარმოებს იგივე ბიოაქტიურ ნაერთებს.ვინაიდან ამ მიკროორგანიზმისგან ბუნებრივი პროდუქტების მიღებაზე ადრეული კვლევები მცირე იყო, შემდგომი ქიმიური კვლევა ჩატარდა.S. werraensis MK493-CF1 ქერის გარემოზე მყარ მდგომარეობაში დუღილის შემდეგ 30°C-ზე 14 დღის განმავლობაში, გარემო იქნა ექსტრაქტული 50% EtOH-ით.60 მლ ნიმუში გაშრეს 59,5 მგ ნედლი ექსტრაქტის მისაღებად.ნედლი ექსტრაქტი დაექვემდებარა შებრუნებული ფაზის HPLC-ს, რათა მისცეს N-მეთოქსი-1H-პიროლ-2-კარბოქსამიდი (1, სახელად კუმამონამიდი, 36.0 მგ).1-ის საერთო რაოდენობა შეადგენს ნედლი ექსტრაქტის დაახლოებით 60%-ს.ამიტომ გადავწყვიტეთ დეტალურად შეგვესწავლა კუმამოტოამიდი 1-ის თვისებები.
კუმამონამიდი 1 არის თეთრი ამორფული ფხვნილი და მაღალი გარჩევადობის მასის სპექტრომეტრია (HRESIMS) ადასტურებს C6H8N2O2 (ნახ. 1).ამ ნაერთის C2-ჩანაცვლებული პიროლის ფრაგმენტი ხასიათდება δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR სპექტრში: 4.5 Hz. , H-5) და δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) და 13C NMR სპექტრი აჩვენებს ოთხი sp2 ნახშირბადის ატომის არსებობას.ამიდური ჯგუფის არსებობა C2 პოზიციაზე შეფასებული იყო HMBC კორელაციით C-3 პროტონიდან ამიდის კარბონილის ნახშირბადთან δC 161.1-ზე.გარდა ამისა, 1 H და 13 C NMR პიკები δH 4.10 (3H, S) და δC 68.3 მიუთითებს N-მეთოქსი ჯგუფების არსებობაზე მოლეკულაში.მიუხედავად იმისა, რომ მეთოქსი ჯგუფის სწორი პოზიცია ჯერ არ იყო განსაზღვრული სპექტროსკოპიული ანალიზის გამოყენებით, როგორიცაა გაძლიერებული განსხვავებების სპექტროსკოპია და ბირთვული Overhauser აბრევიატურა (NOEDF), N-მეთოქსი-1H-პიროლ-2-კარბოქსამიდი გახდა პირველი კანდიდატი ნაერთი.
1-ის სწორი სტრუქტურის დასადგენად ჩატარდა მთლიანი სინთეზი (ნახ. 2ა).კომერციულად ხელმისაწვდომი 2-ამინოპირიდინი 2-ის დამუშავებამ m-CPBA-ით მიიღო შესაბამისი N-ოქსიდი 3 რაოდენობრივი გამოსავლით.2-ის 2-ამინოაზიდაციის შემდეგ, აბრამოვიჩის მიერ აღწერილი ციკლოკონდენსაციის რეაქცია განხორციელდა ბენზოლში 90°C-ზე სასურველი 1-ჰიდროქსი-1H-პიროლ-2-კარბონიტრილი 5 გრამებში მისაღებად.სიჩქარე 60% (ორი ეტაპი).15,16.მეთილაციამ და 4-ის ჰიდროლიზმა შემდეგ მისცა 1-მეთოქსი-1H-პიროლ-2-კარბოქსილის მჟავა (იწოდება "კუმოტონური მჟავა", 6) კარგი გამოსავლით (70%, ორი საფეხური).საბოლოოდ, ამიდაციამ მჟავა ქლორიდის შუალედური მე-6 მეშვეობით წყალხსნარი ამიაკის გამოყენებით მისცა კუმამოტო ამიდს 1 98%-იანი გამოსავლით.სინთეზირებული 1-ის ყველა სპექტრული მონაცემი იზოლირებული 1-ის მსგავსი იყო, ამიტომ განისაზღვრა 1-ის სტრუქტურა;
ურბენამიდისა და ურბენმჟავას ბიოლოგიური აქტივობის ზოგადი სინთეზი და ანალიზი.(ა) კუმამოტო ამიდის მთლიანი სინთეზი.(ბ) შვიდდღიანი ველური ტიპის Arabidopsis Columbia (Col) ნერგები გაიზარდა Murashige და Skoog (MS) ფირფიტებზე, რომლებიც შეიცავს კუმამონამიდს 6 ან კუმამონამიდს 1 მითითებულ კონცენტრაციებში.მასშტაბის ზოლი = 1 სმ.
პირველ რიგში, ჩვენ შევაფასეთ ურბენამიდის და მისი შუალედური ნივთიერებების ბიოლოგიური აქტივობა მცენარის ზრდის მოდულაციის უნარის გამო.ჩვენ დავამატეთ ურსმონამიდ 1-ის ან ურსმონის მჟავას 6-ის სხვადასხვა კონცენტრაცია MS აგარის გარემოში და ამ გარემოზე გავაშენეთ Arabidopsis thaliana ნერგები.ამ ანალიზებმა აჩვენა, რომ 6-ის მაღალი კონცენტრაცია (500 μM) აფერხებს ფესვის ზრდას (ნახ. 2ბ).შემდეგ, ჩვენ შევქმენით სხვადასხვა წარმოებულები 6-ის N1 პოზიციის ჩანაცვლებით და ჩავატარეთ სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთკავშირის კვლევები მათზე (ანალოგების სინთეზის პროცესი აღწერილია დამხმარე ინფორმაციაში (SI)).Arabidopsis-ის ნერგები გაიზარდა გარემოზე, რომელიც შეიცავდა 50 μM ურსონის მჟავას წარმოებულებს და გაზომეს ფესვის სიგრძე.როგორც სურათზეა ნაჩვენები.როგორც ნაჩვენებია სურათებში 3a, b და S1, კუმამოს მჟავებს აქვთ სხვადასხვა სიგრძის ხაზოვანი ალკოქსი ჯაჭვები (9, 10, 11, 12 და 13) ან დიდი ალკოქსი ჯაჭვები (15, 16 და 17) N1 პოზიციაზე.წარმოებულებმა აჩვენეს ფესვების ზრდის მნიშვნელოვანი დათრგუნვა.გარდა ამისა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 200 μM 10, 11 ან 17-ის გამოყენება აფერხებს გამწვანებას (ნახ. 3c და S2).
კუმამოტო ამიდის და მასთან დაკავშირებული ნაერთების სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის შესწავლა.(ა) ანალოგების სტრუქტურისა და სინთეზის სქემა.(ბ) MS გარემოზე გაზრდილი 7-დღიანი ნერგების ფესვის სიგრძის რაოდენობრივი განსაზღვრა 50 μM კუმამონამიდის წარმოებულებით ან მის გარეშე.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე მოჩვენებით მკურნალობასთან (t ტესტი, გვ<0.05).n>18. მონაცემები ნაჩვენებია საშუალოდ ± SD.nt ნიშნავს "არ არის შემოწმებული", რადგან თესლის 50%-ზე მეტი არ აღმოცენდა.(გ) დამუშავებული თესლის გაღივების სიჩქარის რაოდენობრივი განსაზღვრა MS გარემოში 7 დღის განმავლობაში ინკუბირებული 200 μM კუმამონამიდით და მასთან დაკავშირებული ნაერთებით ან მის გარეშე.ვარსკვლავები მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე მოჩვენებით მკურნალობასთან (chi-square ტესტი).n=96.
საინტერესოა, რომ C9-ზე გრძელი ალკილის გვერდითი ჯაჭვების დამატებამ შეამცირა ინჰიბიტორული აქტივობა, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ კუმამოტოის მჟავასთან დაკავშირებულ ნაერთებს სჭირდებათ გარკვეული ზომის გვერდითი ჯაჭვები მათი ბიოლოგიური აქტივობის გამოსავლენად.
იმის გამო, რომ სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის ანალიზმა აჩვენა, რომ C9 იყო მოდიფიცირებული ურსონის მჟავად და ურსონის მჟავას არაილოქსი წარმოებული (შემდგომში KAND 11) იყო მცენარეთა ზრდის ყველაზე ეფექტური ინჰიბიტორი, ჩვენ ჩავატარეთ KAND 11-ის უფრო დეტალური დახასიათება. არაბიდოპსისის მკურნალობა. 50 μM KAND 11-ით თითქმის მთლიანად აფერხებდა გაღივებას, მაშინ როცა KAND 11-ის უფრო დაბალი კონცენტრაციები (40, 30, 20 ან 10 μM) აფერხებდა ფესვების ზრდას დოზადამოკიდებული გზით (ნახ. 4a, b).იმის შესამოწმებლად, მოქმედებს თუ არა KAND 11 ფესვის მერისტემის სიცოცხლისუნარიანობაზე, ჩვენ გამოვიკვლიეთ ფესვის მერისტემები, რომლებიც შეღებილია პროპიდიუმის იოდიდით (PI) და გავზომეთ მერისტემის ფართობის ზომა.25 μM KAND-11-ის შემცველ გარემოზე გაზრდილი ნერგების მერისტემის ზომა იყო 151,1 ± 32,5 μm, ხოლო DMSO-ს შემცველ საკონტროლო გარემოზე გაზრდილი ნერგების მერისტემის ზომა იყო 264,7 ± 30,8 μm (ნახ. 4c, d). , რაც მიუთითებს იმაზე, რომ KAND-11 აღადგენს უჯრედულ აქტივობას.გავრცელება.ფესვის მერისტემი.ამის შესაბამისად, KAND 11 მკურნალობამ შეამცირა უჯრედის გაყოფის მარკერის CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS სიგნალის რაოდენობა ფესვის მერისტემში (ნახ. 4e) 17 .ეს შედეგები მიუთითებს, რომ KAND 11 აფერხებს ფესვების ზრდას უჯრედების პროლიფერაციის აქტივობის შემცირებით.
ურბენონის მჟავას წარმოებულების (ურბენილოქსი წარმოებულების) ინჰიბიტორული ეფექტის ანალიზი ზრდაზე.(ა) 7 დღის წინანდელი ველური ტიპის Col ნერგები, რომლებიც გაიზარდა MS თეფშებზე მითითებული კონცენტრაციით KAND 11. მასშტაბის ბარი = 1 სმ.ბ) ფესვის სიგრძის რაოდენობრივი განსაზღვრა.ასოები მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე (Tukey HSD ტესტი, გვ<0.05).n>16. მონაცემები ნაჩვენებია საშუალოდ ± SD.(გ) პროპიდიუმის იოდიდით შეღებილი ველური ტიპის Col ფესვების კონფოკალური მიკროსკოპია, რომლებიც გაიზარდა MS ფირფიტებზე 25 μM KAND 11-ით ან მის გარეშე. თეთრი ფრჩხილები მიუთითებს ფესვის მერისტემაზე.მასშტაბის ზოლი = 100 μm.(დ) ფესვის მერისტემის ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 10-დან 11-მდე).სტატისტიკური განსხვავებები განისაზღვრა t-ტესტის გამოყენებით (გვ<0.05).ზოლები წარმოადგენს მერისტემის საშუალო ზომას.(ე) დიფერენციალური ჩარევის კონტრასტის (DIC) მიკროსკოპია ფესვის მერისტემის, რომელიც შეიცავს CDKB2 კონსტრუქციას;1პრო: CDKB2;1-GUS შეღებილი და შეღებილი 5 დღის წინანდელ ნერგებზე, რომლებიც გაიზარდა MS ფირფიტებზე 25 μM KAND ანალიზით ან მის გარეშე.
KAND 11-ის ფიტოტოქსიურობა შემდგომში შემოწმდა კიდევ ერთი ორწახნაგოვანი მცენარის, თამბაქოს (Nicotiana tabacum) და ძირითადი მიწის მცენარეული მოდელის ორგანიზმის, ღვიძლი (Marchantia polymorpha) გამოყენებით.როგორც Arabidopsis-ის შემთხვევაში, თამბაქოს SR-1 ნერგები, რომლებიც გაიზარდა 25 μM KAND 11-ის შემცველ გარემოზე, უფრო მოკლე ფესვებს ქმნიდა (ნახ. 5a).გარდა ამისა, 48 თესლიდან 40 აღმოცენდა თეფშებზე, რომლებიც შეიცავდა 200 μM KAND 11-ს, ხოლო 48-ვე თესლი აღმოცენდა იმიტირებულ გარემოზე, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ KAND-ის უფრო მაღალი კონცენტრაცია მნიშვნელოვანი იყო (p.< 0,05;ჩი ტესტი - კვადრატი) აფერხებდა თამბაქოს აღმოცენებას.(ნახ. 5ბ).გარდა ამისა, KAND 11-ის კონცენტრაცია, რომელიც აფერხებდა ბაქტერიების ზრდას ღვიძლში, მსგავსი იყო ეფექტური კონცენტრაციისა არაბიდოპსისში (ნახ. 5c).ეს შედეგები მიუთითებს, რომ KAND 11-ს შეუძლია შეაფერხოს სხვადასხვა მცენარეების ზრდა.შემდეგ ჩვენ გამოვიკვლიეთ დათვის მონოამიდთან დაკავშირებული ნაერთების შესაძლო ციტოტოქსიკურობა სხვა ორგანიზმებში, კერძოდ, ადამიანის HeLa უჯრედებში და Escherichia coli შტამების DH5α, როგორც უმაღლესი ცხოველური და ბაქტერიული უჯრედების წარმომადგენლები, შესაბამისად.უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზის სერიებში, ჩვენ დავაკვირდით, რომ კუმამონამიდი 1, კუმამონამიდის მჟავა 6 და KAND 11 არ ახდენდნენ გავლენას HeLa ან E. coli უჯრედების ზრდაზე 100 μM კონცენტრაციით (ნახ. 5d,e).
KAND 11-ის ზრდის ინჰიბიცია არაარაბიდოპსის ორგანიზმებში.(ა) ორკვირიანი ველური ტიპის SR-1 თამბაქოს ნერგები გაიზარდა ვერტიკალურად განლაგებულ MS ფირფიტებზე, რომლებიც შეიცავდა 25 μM KAND 11. (ბ) ორკვირიანი ველური ტიპის SR-1 თამბაქოს ნერგები გაიზარდა ჰორიზონტალურად განლაგებულზე. MS ფირფიტები, რომლებიც შეიცავს 200 μM KAND 11. (გ) ორკვირიანი ველური ტიპის Tak-1 ღვიძლის კვირტი, გაზრდილი Gamborg B5 ფირფიტებზე KAND 11 მითითებული კონცენტრაციით. წითელი ისრები მიუთითებს სპორებზე, რომლებმაც შეწყვიტეს ზრდა ორკვირიანი ინკუბაციით. პერიოდი.(დ) HeLa უჯრედების უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზი.სიცოცხლისუნარიანი უჯრედების რაოდენობა გაზომილი იყო ფიქსირებული დროის ინტერვალებით, უჯრედების დათვლის ნაკრების 8 (დოჟინდო) გამოყენებით.როგორც კონტროლი, HeLa უჯრედებს მკურნალობდნენ 5 მკგ/მლ აქტინომიცინით D (Act D), რომელიც აფერხებს რნმ პოლიმერაზას ტრანსკრიფციას და იწვევს უჯრედის სიკვდილს.ანალიზები ჩატარდა სამჯერ.(ე) E. coli უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზი.E. coli ზრდა გაანალიზდა OD600 გაზომვით.როგორც კონტროლი, უჯრედები დამუშავდა 50 მკგ/მლ ამპიცილინით (Amp), რომელიც აფერხებს ბაქტერიული უჯრედის კედლის სინთეზს.ანალიზები ჩატარდა სამჯერ.
ურამიდთან დაკავშირებული ნაერთებით გამოწვეული ციტოტოქსიურობის მოქმედების მექანიზმის გასაშიფრად, ჩვენ ხელახლა გავაანალიზეთ ურბენის მჟავას წარმოებულები ზომიერი ინჰიბიტორული ეფექტით.როგორც სურათზეა ნაჩვენები.როგორც ნაჩვენებია 2b, 6a სურათზე, აგარის ფირფიტებზე გაზრდილი ნერგები, რომლებიც შეიცავს ურმოტონური მჟავას 6-ის მაღალ კონცენტრაციებს (200 μM) წარმოქმნიან უფრო მოკლე და მარცხნივ მოხრილ ფესვებს (θ = – 23.7 ± 6.1), ხოლო საკონტროლო გარემოზე გაზრდილი ნერგები, ნერგები წარმოქმნიან თითქმის სწორ ფესვებს (θ = – 3,8 ± 7,1).ცნობილია, რომ ეს დამახასიათებელი ირიბი ზრდა გამოწვეულია კორტიკალური მიკროტუბულების დისფუნქციით14,18.ამ დასკვნის შესაბამისად, მიკროტუბულების დესტაბილიზაციის წამლებმა დიზოპირამიდი და ორიზალინი იწვევდნენ ფესვების მსგავსი დახრილობას ჩვენი ზრდის პირობებში (ნახ. 2b, 6a).ამავდროულად, ჩვენ გამოვცადეთ ურმოტონური მჟავის წარმოებულები და შევარჩიეთ რამდენიმე მათგანი, რომლებიც გარკვეულ კონცენტრაციებში იწვევდნენ ფესვის ირიბი ზრდას.ნაერთებმა 8, 9 და 15 შეცვალეს ფესვის ზრდის მიმართულება 75 μM, 50 μM და 40 μM, შესაბამისად, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ამ ნაერთებს შეუძლიათ მიკროტუბულების ეფექტური დესტაბილიზაცია (ნახ. 2b, 6a).ჩვენ ასევე გამოვცადეთ ურსოლის მჟავის ყველაზე ძლიერი წარმოებული, KAND 11, უფრო დაბალ კონცენტრაციაზე (15 μM) და აღმოვაჩინეთ, რომ KAND 11-ის გამოყენება აფერხებს ფესვების ზრდას და რომ ფესვის ზრდის მიმართულება არათანაბარი იყო, თუმცა ისინი მიდრეკილნი იყვნენ მარცხნივ. სურათი C3)..იმის გამო, რომ მიკროტუბულების დესტაბილიზაციის წამლების უფრო მაღალი კონცენტრაცია ზოგჯერ აფერხებს მცენარის ზრდას, ვიდრე იწვევს ფესვის დახრილობას, ჩვენ შემდგომ შევაფასეთ შესაძლებლობა, რომ KAND 11 იმოქმედოს მიკროტუბულებზე ფესვის ეპიდერმული უჯრედების კორტიკალურ მიკროტუბულებზე დაკვირვებით.იმუნოჰისტოქიმია ანტი-β-ტუბულინის ანტისხეულების გამოყენებით ჩითილის ფესვების ეპიდერმისულ უჯრედებში, დამუშავებული 25 μM KAND 11-ით, აჩვენა თითქმის ყველა კორტიკალური მიკროტუბულის გაქრობა ეპიდერმული უჯრედებში დრეკადობის ზონაში (ნახ. 6b).ეს შედეგები მიუთითებს, რომ კუმამოტონური მჟავა და მისი წარმოებულები პირდაპირ ან ირიბად მოქმედებენ მიკროტუბულებზე მათი დარღვევის მიზნით და რომ ეს ნაერთები ახალი მიკროტუბულების ინჰიბიტორებია.
ურსონის მჟავა და მისი წარმოებულები ცვლის კორტიკალურ მიკროტუბულებს Arabidopsis thaliana-ში.ა) ფესვის დახრილობის კუთხე გაზომილი ურმოტონური მჟავას სხვადასხვა წარმოებულების არსებობისას მითითებულ კონცენტრაციებში.ასევე გაანალიზებული იყო ორი ნაერთის ეფექტები, რომლებიც აინჰიბირებენ მიკროტუბულებს: დიზოპირამიდი და ორიზალინი.ჩანართი აჩვენებს სტანდარტს, რომელიც გამოიყენება ფესვის ზრდის კუთხის გასაზომად.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე მოჩვენებით მკურნალობასთან (t ტესტი, გვ<0.05).n>19. სასწორის ზოლი = 1 სმ.ბ) კორტიკალური მიკროტუბულები ეპიდერმისის უჯრედებში დრეკადობის ზონაში.მიკროტუბულები ველური ტიპის Arabidopsis Col ფესვებში, რომლებიც გაიზარდა MS ფირფიტებზე 25 μM KAND 11-ით ან მის გარეშე, ვიზუალური იყო იმუნოჰისტოქიმიური შეღებვით β-ტუბულინის პირველადი ანტისხეულების და Alexa Fluor-ის კონიუგირებული მეორადი ანტისხეულების გამოყენებით.მასშტაბის ზოლი = 10 μm.გ) ფესვის მერისტემის მიკროტუბულების მიტოზური სტრუქტურა.მიკროტუბულების ვიზუალიზაცია მოხდა იმუნოჰისტოქიმიური შეღებვის გამოყენებით.მიტოზური სტრუქტურები, მათ შორის პროფაზური ზონები, შპინდლები და ფრაგმოპლასტები, დათვლილი იყო კონფოკალური სურათებიდან.ისრები მიუთითებს მიტოზურ მიკროტუბულურ სტრუქტურებზე.ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე მოჩვენებით მკურნალობასთან (t ტესტი, გვ<0.05).n>9. მასშტაბის ზოლი = 50 μm.
მიუხედავად იმისა, რომ ურსას აქვს მიკროტუბულების ფუნქციის დარღვევის უნარი, მოსალოდნელია, რომ მისი მოქმედების მექანიზმი განსხვავდება ტიპიური მიკროტუბულების დეპოლიმერიზაციის აგენტებისგან.მაგალითად, მიკროტუბულების დეპოლიმერიზაციის აგენტების უფრო მაღალი კონცენტრაცია, როგორიცაა დიზოპირამიდი და ორიზალინი, იწვევს ეპიდერმული უჯრედების ანიზოტროპულ გაფართოებას, ხოლო KAND 11 არა.გარდა ამისა, KAND 11-ისა და დიზოპირამიდის ერთობლივმა გამოყენებამ გამოიწვია ფესვების ზრდის კომბინირებული დიზოპირამიდით გამოწვეული პასუხი და KAND 11-ით გამოწვეული ზრდის დათრგუნვა დაფიქსირდა (ნახ. S4).ჩვენ ასევე გავაანალიზეთ ჰიპერმგრძნობიარე დიზოპირამიდის 1-1 (phs1-1) მუტანტის რეაქცია KAND 11-ზე. phs1-1-ს აქვს არაკანონიკური ტუბულინკინაზას წერტილის მუტაცია და წარმოქმნის უფრო მოკლე ფესვებს დისოპირამიდით9,20 დამუშავებისას.phs1-1 მუტანტის ნერგებს, რომლებიც გაიზარდა აგარის გარემოზე, რომელიც შეიცავს KAND 11-ს, ჰქონდათ უფრო მოკლე ფესვები, როგორც დიზოპირამიდზე გაზრდილი (ნახ. S5).
გარდა ამისა, ჩვენ დავაკვირდით მიტოზურ მიკროტუბულურ სტრუქტურებს, როგორიცაა პროფაზური ზონები, შტრიხები და ფრაგმოპლასტები, KAND 11-ით დამუშავებული ნერგების ფესვის მერისტემაში. შეესაბამება CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-ის დაკვირვებებს, მნიშვნელოვანი შემცირება. დაფიქსირდა მიტოზური მიკროტუბულების რაოდენობა (ნახ. .6c).
KAND 11-ის ციტოტოქსიურობის დასახასიათებლად სუბცელულარული რეზოლუციით, ჩვენ დავამუშავეთ თამბაქოს BY-2 სუსპენზიის უჯრედები KAND 11-ით და დავაკვირდით მათ პასუხს.ჩვენ პირველად დავამატეთ KAND 11 BY-2 უჯრედებს, რომლებიც გამოხატავენ TagRFP-TUA6, რომელიც ფლუორესცენტულად ასახელებს მიკროტუბულებს, რათა შევაფასოთ KAND 11-ის ეფექტი კორტიკალურ მიკროტუბულებზე.კორტიკალური მიკროტუბულების სიმკვრივე შეფასდა გამოსახულების ანალიზის გამოყენებით, რომელიც რაოდენობრივად ადგენდა ციტოჩონჩხის პიქსელების პროცენტს ციტოპლაზმურ პიქსელებს შორის.ანალიზის შედეგებმა აჩვენა, რომ 50 μM ან 100 μM KAND 11-ით მკურნალობის შემდეგ 1 საათის განმავლობაში, სიმკვრივე მნიშვნელოვნად შემცირდა 0.94 ± 0.74% ან 0.23 ± 0.28%, შესაბამისად, ხოლო DMSO დამუშავებული უჯრედების სიმკვრივე შეადგენდა 1.631 ± 0.631-ს. % (ნახ. 7ა).ეს შედეგები შეესაბამება Arabidopsis-ის დაკვირვებას, რომ KAND 11 მკურნალობა იწვევს კორტიკალური მიკროტუბულების დეპოლიმერიზაციას (ნახ. 6b).ჩვენ ასევე გამოვიკვლიეთ BY-2 ხაზი GFP-ABD-ის მარკირებული აქტინის ძაფებით KAND 11-ის იგივე კონცენტრაციით მკურნალობის შემდეგ და დავაკვირდით, რომ KAND 11 მკურნალობა არღვევს აქტინის ძაფებს.50 μM ან 100 μM KAND 11-ით დამუშავებამ 1 საათის განმავლობაში მნიშვნელოვნად შეამცირა აქტინის ძაფის სიმკვრივე 1,20 ± 0,62% ან 0,61 ± 0,26%, შესაბამისად, ხოლო DMSO დამუშავებულ უჯრედებში სიმკვრივე იყო 1,69 ± 0,51% (ნახ. 0,51%).7ბ).ეს შედეგები ეწინააღმდეგება პროპიზამიდის ეფექტს, რომელიც არ მოქმედებს აქტინის ძაფებზე და ლატრუნკულინ B-ს, აქტინის დეპოლიმერიზატორის, რომელიც არ მოქმედებს მიკროტუბულებზე ( SI სურათი S6).გარდა ამისა, მკურნალობა კუმამონამიდ 1-ით, კუმამონამიდის მჟავით 6 ან KAND 11-ით არ იმოქმედა მიკროტუბულებზე HeLa უჯრედებში (SI სურათი S7).ამრიგად, ითვლება, რომ KAND 11-ის მოქმედების მექანიზმი განსხვავდება ციტოჩონჩხის ცნობილი დამრღვევებისგან.გარდა ამისა, ჩვენმა მიკროსკოპულმა დაკვირვებამ BY-2 უჯრედებზე, რომლებიც მკურნალობდნენ KAND 11-ით, გამოავლინა უჯრედების სიკვდილის დაწყება KAND 11 მკურნალობის დროს და აჩვენა, რომ ევანსის ლურჯად შეღებილი მკვდარი უჯრედების პროპორცია მნიშვნელოვნად არ გაიზარდა KAND 11 მკურნალობის 30 წუთის შემდეგ, მაშინ როცა 50 μM ან 100 μM KAND-ით მკურნალობის 90 წუთის შემდეგ, მკვდარი უჯრედების რაოდენობა გაიზარდა 43.7%-მდე ან 80.1%-მდე, შესაბამისად (ნახ. 7c).ერთად აღებული, ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ ურსოლის მჟავას ახალი წარმოებული KAND 11 არის მცენარეებისთვის სპეციფიკური ციტოჩონჩხის ინჰიბიტორი მოქმედების მანამდე უცნობი მექანიზმით.
KAND გავლენას ახდენს კორტიკალურ მიკროტუბულებზე, აქტინის ძაფებზე და თამბაქოს BY-2 უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობაზე.(ა) კორტიკალური მიკროტუბულების ვიზუალიზაცია BY-2 უჯრედებში TagRFP-TUA6-ის თანდასწრებით.BY-2 უჯრედები დამუშავებული KAND 11 (50 μM ან 100 μM) ან DMSO გამოკვლეული იყო კონფოკალური მიკროსკოპით.კორტიკალური მიკროტუბულების სიმკვრივე გამოითვალა 25 დამოუკიდებელი უჯრედის მიკროგრაფიებიდან.ასოები მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე (Tukey HSD ტესტი, გვ<0.05).მასშტაბის ზოლი = 10 μm.(ბ) კორტიკალური აქტინის ძაფები BY-2 უჯრედებში ვიზუალურად GFP-ABD2-ის თანდასწრებით.BY-2 უჯრედები დამუშავებული KAND 11 (50 μM ან 100 μM) ან DMSO გამოკვლეული იყო კონფოკალური მიკროსკოპით.კორტიკალური აქტინის ძაფების სიმკვრივე გამოითვალა 25 დამოუკიდებელი უჯრედის მიკროგრაფიიდან.ასოები მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე (Tukey HSD ტესტი, გვ<0.05).მასშტაბის ზოლი = 10 μm.(გ) მკვდარი BY-2 უჯრედების დაკვირვება ევანსის ლურჯი შეღებვით.BY-2 უჯრედები დამუშავებული KAND 11 (50 μM ან 100 μM) ან DMSO გამოკვლეული იყო ნათელი ველის მიკროსკოპით.n=3.მასშტაბის ზოლი = 100 μm.
ახალი ბუნებრივი პროდუქტების აღმოჩენამ და გამოყენებამ გამოიწვია მნიშვნელოვანი წინსვლა ადამიანის ცხოვრების სხვადასხვა ასპექტში, მათ შორის მედიცინასა და სოფლის მეურნეობაში.ბუნებრივი რესურსებიდან სასარგებლო ნაერთების მისაღებად ჩატარდა ისტორიული კვლევა.კერძოდ, აქტინომიცეტები ცნობილია, როგორც ანტიპარაზიტული ანტიბიოტიკები ნემატოდებისთვის, მათი უნარის გამო წარმოქმნან სხვადასხვა მეორადი მეტაბოლიტები, როგორიცაა ავერმექტინი, ივერმექტინისა და ბლეომიცინის ტყვიის ნაერთი და მისი წარმოებულები, რომლებიც გამოიყენება მედიცინაში, როგორც კიბოს საწინააღმდეგო აგენტი21,22.ანალოგიურად, სხვადასხვა ჰერბიციდური ნაერთები აღმოაჩინეს აქტინომიცეტებიდან, რომელთაგან ზოგიერთი უკვე გამოიყენება კომერციულად1,23.აქედან გამომდინარე, აქტინომიცეტების მეტაბოლიტების ანალიზი სასურველი ბიოლოგიური აქტივობის მქონე ბუნებრივი პროდუქტების იზოლირებისთვის ითვლება ეფექტურ სტრატეგიად.ამ კვლევაში ჩვენ აღმოვაჩინეთ ახალი ნაერთი, კუმამონამიდი, S. werraensis-ისგან და წარმატებით მოვახდინეთ მისი სინთეზი.ურსონის მჟავა არის ურბენამიდის და მისი წარმოებულების სინთეზური შუამავალი.მას შეუძლია გამოიწვიოს ფესვების დამახასიათებელი დახვევა, გამოავლინოს ზომიერი ან ძლიერი ჰერბიციდური მოქმედება და პირდაპირ ან ირიბად დააზიანოს მცენარის მიკროტუბულები.თუმცა, ურმოტონური მჟავას მოქმედების მექანიზმი შეიძლება განსხვავდებოდეს არსებული მიკროტუბულური ინჰიბიტორებისგან, რადგან KAND 11 ასევე არღვევს აქტინის ძაფებს და იწვევს უჯრედის სიკვდილს, რაც მიუთითებს მარეგულირებელ მექანიზმზე, რომლითაც ურმოტონური მჟავა და მისი წარმოებულები გავლენას ახდენენ ციტოჩონჩხის სტრუქტურების ფართო სპექტრზე..
ურბენონის მჟავას შემდგომი დეტალური დახასიათება ხელს შეუწყობს ურბენონის მჟავას მოქმედების მექანიზმის უკეთ გაგებას.კერძოდ, შემდეგი მიზანია შეაფასოს ურსონის მჟავის უნარი შეერთოს შემცირებულ მიკროტუბულებთან, რათა დადგინდეს, მოქმედებს თუ არა ურსონის მჟავა და მისი წარმოებულები უშუალოდ მიკროტუბულებზე და ახდენს მათ დეპოლიმერიზაციას, ან იწვევს თუ არა მათი მოქმედება მიკროტუბულების დესტაბილიზაციას.გარდა ამისა, იმ შემთხვევაში, როდესაც მიკროტუბულები არ არის პირდაპირი სამიზნე, მცენარეთა უჯრედებზე ურსონის მჟავას მოქმედების ადგილისა და მოლეკულური სამიზნეების იდენტიფიცირება ხელს შეუწყობს მასთან დაკავშირებული ნაერთების თვისებების და ჰერბიციდური აქტივობის გაუმჯობესების შესაძლო გზებს.ჩვენმა ბიოაქტიურობის ანალიზმა გამოავლინა ურსონის მჟავას უნიკალური ციტოტოქსიური უნარი ისეთი მცენარეების ზრდაზე, როგორიცაა Arabidopsis thaliana, თამბაქო და ღვიძლის ჯიში, მაშინ როცა არც E. coli და არც HeLa უჯრედები არ დაზარალდნენ.ცხოველური უჯრედებისთვის მცირე ტოქსიკურობა ან საერთოდ არ არის ურსონის მჟავას წარმოებულების უპირატესობა, თუ ისინი შემუშავებულია ჰერბიციდების სახით ღია სასოფლო-სამეურნეო მინდვრებში გამოსაყენებლად.მართლაც, ვინაიდან მიკროტუბულები საერთო სტრუქტურებია ევკარიოტებში, მათი შერჩევითი დათრგუნვა მცენარეებში არის ძირითადი მოთხოვნა ჰერბიციდებისთვის.მაგალითად, პროპიზამიდი, მიკროტუბულების დეპოლიმერიზაციის აგენტი, რომელიც პირდაპირ აკავშირებს ტუბულინს და აფერხებს პოლიმერიზაციას, გამოიყენება ჰერბიციდად ცხოველური უჯრედებისთვის დაბალი ტოქსიკურობის გამო24.დიზოპირამიდისგან განსხვავებით, დაკავშირებულ ბენზამიდებს აქვთ განსხვავებული სამიზნე სპეციფიკა.მცენარეთა მიკროტუბულების გარდა, RH-4032 ან ბენზოქსამიდი ასევე აფერხებს ცხოველური უჯრედების ან ოომიცეტების მიკროტუბულებს, შესაბამისად, და ზალილამიდი გამოიყენება როგორც ფუნგიციდი დაბალი ფიტოტოქსიკურობის გამო25,26,27.ახლად აღმოჩენილი დათვი და მისი წარმოებულები ავლენენ შერჩევით ციტოტოქსიურობას მცენარეების მიმართ, მაგრამ აღსანიშნავია, რომ შემდგომმა მოდიფიკაციამ შეიძლება შეცვალოს მათი სამიზნე სპეციფიკა, პოტენციურად უზრუნველყოს დამატებითი წარმოებულები პათოგენური სოკოების ან ოომიცეტების კონტროლისთვის.
ურბენონის მჟავისა და მისი წარმოებულების უნიკალური თვისებები სასარგებლოა მათი განვითარებისათვის, როგორც ჰერბიციდები და გამოიყენება როგორც კვლევის ინსტრუმენტები.ფართოდ არის აღიარებული ციტოჩონჩხის მნიშვნელობა მცენარეთა უჯრედის ფორმის კონტროლში.ადრეულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ მცენარეებმა განავითარეს კორტიკალური მიკროტუბულების ორგანიზების რთული მექანიზმები მიკროტუბულების დინამიკის კონტროლით, მორფოგენეზის სწორად გასაკონტროლებლად.იდენტიფიცირებულია მოლეკულების დიდი რაოდენობა, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან მიკროტუბულების აქტივობის რეგულირებაზე და დაკავშირებული კვლევები ჯერ კიდევ მიმდინარეობს3,4,28.მცენარეთა უჯრედებში მიკროტუბულების დინამიკის ჩვენი ამჟამინდელი გაგება სრულად არ ხსნის კორტიკალური მიკროტუბულების ორგანიზების მექანიზმებს.მაგალითად, მიუხედავად იმისა, რომ როგორც დიზოპირამიდს, ასევე ორიზალინს შეუძლიათ მიკროტუბულების დეპოლიმერიზაცია, დიზოპირამიდი იწვევს ფესვების ძლიერ დამახინჯებას, ხოლო ორიზალინს აქვს შედარებით რბილი ეფექტი.გარდა ამისა, მუტაციები ტუბულინში, რომელიც ასტაბილურებს მიკროტუბულებს, ასევე იწვევს ფესვების დექსტროროტაციას, ხოლო პაკლიტაქსელი, რომელიც ასევე ასტაბილურებს მიკროტუბულების დინამიკას, არა.ამიტომ, ურსოლის მჟავას მოლეკულური სამიზნეების შესწავლამ და იდენტიფიცირებამ უნდა უზრუნველყოს ახალი შეხედულებები მცენარეთა კორტიკალური მიკროტუბულების რეგულირების შესახებ.ანალოგიურად, ქიმიკატების მომავალი შედარება, რომლებიც ეფექტურია დამახინჯებული ზრდის ხელშეწყობაში, როგორიცაა დიზოპირამიდი, და ნაკლებად ეფექტური ქიმიკატების, როგორიცაა ორიზალინი ან კუმამოტორული მჟავა, იძლევა მინიშნებებს იმის შესახებ, თუ როგორ ხდება დამახინჯებული ზრდა.
მეორეს მხრივ, თავდაცვასთან დაკავშირებული ციტოჩონჩხის გადაკეთება კიდევ ერთი შესაძლებლობაა ურსონის მჟავის ციტოტოქსიკურობის ასახსნელად.პათოგენის ინფექცია ან ელიციტორის შეყვანა მცენარეულ უჯრედებში ზოგჯერ იწვევს ციტოჩონჩხის განადგურებას და შემდგომ უჯრედის სიკვდილს29.მაგალითად, ცნობილია, რომ ოომიცეტიდან მიღებული კრიპტოქსანტინი არღვევს მიკროტუბულებსა და აქტინის ძაფებს თამბაქოს უჯრედების სიკვდილამდე, ისევე როგორც KAND მკურნალობისას30,31.მსგავსებამ თავდაცვით პასუხებსა და ურსონის მჟავით გამოწვეულ უჯრედულ რეაქციებს შორის მიგვიყვანა ჰიპოთეზაზე, რომ ისინი იწვევენ საერთო უჯრედულ პროცესებს, თუმცა აშკარაა ურსონის მჟავას უფრო სწრაფი და ძლიერი ეფექტი, ვიდრე კრიპტოქსანტინი.თუმცა, კვლევებმა აჩვენა, რომ აქტინის ძაფების მოშლა ხელს უწყობს უჯრედების სპონტანურ სიკვდილს, რასაც ყოველთვის არ ახლავს მიკროტუბულების დარღვევა29.გარდა ამისა, ჯერ კიდევ გასარკვევია, იწვევს თუ არა პათოგენი ან გამომწვევი ფესვების დამახინჯებულ ზრდას, როგორც ამას აკეთებენ ურსონის მჟავას წარმოებულები.ამრიგად, მოლეკულური ცოდნა, რომელიც აკავშირებს თავდაცვის პასუხებსა და ციტოჩონჩხს, არის მიმზიდველი პრობლემა, რომელიც უნდა გადაიჭრას.ურსონის მჟავასთან დაკავშირებული დაბალი მოლეკულური წონის ნაერთების არსებობით, ისევე როგორც სხვადასხვა სიმძლავრის მქონე წარმოებულების არსებობის გამოყენებით, მათ შეუძლიათ უზრუნველყონ უცნობი უჯრედული მექანიზმების მიზნობრივი მიზნების მიღწევა.
ერთად აღებული, ახალი ნაერთების აღმოჩენა და გამოყენება, რომლებიც ახდენენ მიკროტუბულების დინამიკის მოდულირებას, უზრუნველყოფენ მძლავრ მეთოდებს მცენარეთა უჯრედის ფორმის განსაზღვრაში არსებული რთული მოლეკულური მექანიზმების გადასაჭრელად.ამ კონტექსტში, ახლახან შემუშავებულმა ნაერთმა ურმოტონური მჟავა, რომელიც გავლენას ახდენს მიკროტუბულებზე და აქტინის ძაფებზე და იწვევს უჯრედების სიკვდილს, შეიძლება უზრუნველყოს მიკროტუბულების კონტროლსა და ამ სხვა მექანიზმებს შორის კავშირის გაშიფვრის შესაძლებლობა.ამრიგად, ურბენონის მჟავის გამოყენებით ქიმიური და ბიოლოგიური ანალიზი დაგვეხმარება გავიგოთ მოლეკულური მარეგულირებელი მექანიზმები, რომლებიც აკონტროლებენ მცენარის ციტოჩონჩხს.
ჩაასხით S. werraensis MK493-CF1 500 მლ დაბნეულ ერლენმაიერის კოლბაში, რომელიც შეიცავს 110 მლ სათესლე გარემოს, რომელიც შედგება 2% (w/v) გალაქტოზისგან, 2% (w/v) ესენციის პასტა, 1% (w/v) Bacto შემადგენლობა. .-სოიტონი (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) სიმინდის ექსტრაქტი (KOGOSTCH Co., Ltd., იაპონია), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 და 0.2% CaCO3 დეიონიზებულ წყალში.(pH 7.4 სტერილიზაციამდე).თესლის კულტურები ინკუბირებული იყო მბრუნავ შაკერზე (180 rpm) 27°C ტემპერატურაზე 2 დღის განმავლობაში.წარმოების კულტივირება მყარი მდგომარეობის ფერმენტაციის გზით.თესლის კულტურა (7 მლ) გადაიტანეს 500 მლ K-1 კოლბაში, რომელიც შეიცავდა 40 გ საწარმოო გარემოს, რომელიც შედგებოდა 15 გ დაპრესილი ქერის (MUSO Co., Ltd., იაპონია) და 25 გ დეიონიზებული წყლისგან (pH არ არის დარეგულირებული. სტერილიზაციამდე).).დუღილი ტარდებოდა 30°C სიბნელეში 14 დღის განმავლობაში.დუღილის მასალა ამოღებულია 40 მლ/ბოთლი EtOH და ცენტრიფუგირებულია (1500 გ, 4°C, 10 წთ).კულტურის სუპერნატანტი (60 მლ) ამოღებულია 10% MeOH/EtOAc ნარევით.ორგანული ფენა აორთქლდა შემცირებული წნევის ქვეშ ნარჩენის მისაღებად (59,5 მგ), რომელიც დაექვემდებარა HPLC-ს გრადიენტური გამორეცხვით (0–10 წუთი: 90%) საპირისპირო ფაზის სვეტზე (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID. 10 მმ × სიგრძე 250 მმ) H2O/CH3CN, 10–35 წუთი: 90% H2O/CH3CN 70% H2O/CH3CN (გრადიენტი), 35–45 წუთი: 90% H2O/EtOH, 45–155 წუთი: 90% H2O /EtOH 100% EtOH (გრადიენტი (გრადიენტი), 155–200 წთ: 100% EtOH) 1,5 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით, კუმამონამიდი (1, 36,0 მგ) იზოლირებული იყო თეთრი ამორფული ფხვნილის სახით.
კუმამოტოამიდი (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ გამოთვლილი მნიშვნელობა: 141.0659, გაზომილი მნიშვნელობა: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593-153 სმ.
კოლუმბიის თესლი (Col-0) მიღებული იქნა არაბიდოპსისის ბიოლოგიური რესურსების ცენტრიდან (ABRC) კვლევის გამოყენების ნებართვით.Col-0 თესლი გამრავლდა და შენარჩუნდა ჩვენს ლაბორატორიულ პირობებში და გამოიყენებოდა როგორც ველური ტიპის Arabidopsis მცენარეები.არაბიდოპსისის თესლი ზედაპირულად სტერილიზებულია და კულტივირებულია ნახევრად გამძლე მურაშიგესა და სკუგ გარემოში, რომელიც შეიცავს 2% საქაროზას (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-მორფოლინო)ეთანსულფონის მჟავას (MES) (Fujifilm Wako Pure C). ).) და 1.5% აგარი (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, 23 °C-ზე და მუდმივ შუქზე.phs1-1 მუტანტის თესლი მოწოდებული იყო ტ. ჰაშიმოტოს მიერ (ნარას მეცნიერებისა და ტექნოლოგიების ინსტიტუტი).
SR-1 შტამის თესლები მოწოდებული იყო ტ. ჰაშიმოტოს მიერ (ნარას მეცნიერებისა და ტექნოლოგიების ინსტიტუტი) და გამოიყენებოდა როგორც ველური ტიპის თამბაქოს მცენარეები.თამბაქოს თესლები ზედაპირულად სტერილიზებული და გაჟღენთილი იყო სტერილურ წყალში სამი ღამის განმავლობაში, რათა ხელი შეუწყოს გამწვანებას, შემდეგ მოათავსეს ნახევრად გამძლე ხსნარში, რომელიც შეიცავს 2% საქაროზას, 0.05% (w/v) MES და 0.8% გელანის რეზინას (Fujifilm Wako Pure Chemical). მურაშიგე.და Skoog საშუალო) pH 5.7 და ინკუბირებულია 23°C-ზე მუდმივი სინათლის ქვეშ.
შტამი Tak-1 მოწოდებული იყო T. Kohchi-ს მიერ (კიოტოს უნივერსიტეტი) და გამოიყენებოდა როგორც სტანდარტული ექსპერიმენტული ერთეული ღვიძლის ჯიშის კვლევისთვის.გემა მიიღეს სტერილიზებული კულტივირებული მცენარეებიდან და შემდეგ დარგეს Gamborg B5 გარემოზე (Fujifilm Wako Pure Chemical), რომელიც შეიცავდა 1% საქაროზას და 0.3% გელანის რეზინას და ინკუბირებული იყო 23°C-ზე უწყვეტი სინათლის ქვეშ.
თამბაქოს BY-2 უჯრედები (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) მოწოდებული იყო S. Hasezawa-ს მიერ (ტოკიოს უნივერსიტეტი).BY-2 უჯრედები განზავებული იყო 95-ჯერ მოდიფიცირებულ Linsmeier და Skoog გარემოში და ყოველკვირეულად ავსებდნენ 2,4-დიქლოროფენოქსიაძმარმჟავას 32.უჯრედის სუსპენზია შერეული იყო მბრუნავ შეიკერზე 130 rpm-ზე 27°C სიბნელეში.გარეცხეთ უჯრედები 10-ჯერ მეტი მოცულობით სუფთა საშუალებით და ხელახლა გააჩერეთ იმავე გარემოში.BY-2 ტრანსგენური უჯრედული ხაზები, რომლებიც სტაბილურად გამოხატავენ მიკროტუბულურ მარკერს TagRFP-TUA6 ან აქტინის ძაფის მარკერს GFP-ABD2 ყვავილოვანი კომბოსტოს მოზაიკის ვირუსის 35S პრომოტორის ქვეშ, გენერირებული იყო, როგორც აღწერილია33,34,35.ამ უჯრედული ხაზების შენარჩუნება და სინქრონიზაცია შესაძლებელია იმ პროცედურების გამოყენებით, რომლებიც გამოიყენება ორიგინალური BY-2 უჯრედული ხაზისთვის.
HeLa უჯრედები კულტივირებული იყო Dulbecco-ს მოდიფიცირებულ Eagle-ის გარემოში (DMEM) (Life Technologies), რომელსაც დაემატა 10% ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატი, 1.2 U/ml პენიცილინი და 1.2 μg/ml სტრეპტომიცინი 37°C ინკუბატორში 5% CO2-ით.
ამ ხელნაწერში აღწერილი ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა იაპონური ბიოუსაფრთხოების რეგულაციებისა და გაიდლაინების შესაბამისად.
ნაერთები იხსნება დიმეთილ სულფოქსიდში (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) როგორც საფუძვლიანი ხსნარები და განზავებულია MS გარემოში Arabidopsis-ისთვის და თამბაქოსთვის ან Gamborg B5 გარემოში ღვიძლისთვის.ფესვის ზრდის დათრგუნვის ანალიზისთვის, თეფშზე 10-ზე მეტი თესლი დათესეს აგარის გარემოზე, რომელიც შეიცავს მითითებულ ნაერთებს ან DMSO.თესლი ინკუბირებული იყო ზრდის პალატაში 7 დღის განმავლობაში.ნერგები გადაიღეს და გაზომეს ფესვების სიგრძე.Arabidopsis აღმოცენების ანალიზისთვის, 48 თესლი თითო თეფშზე დათესეს აგარის გარემოზე, რომელიც შეიცავს 200 μM ნაერთს ან DMSO.არაბიდოპსისის თესლი გაიზარდა ზრდის პალატაში და გაღივებული ნერგების რაოდენობა დათვლილი იყო გაღივებიდან 7 დღის შემდეგ (დაგ).თამბაქოს აღმოცენების ანალიზისთვის, თითო თეფშზე 24 თესლი დათესეს აგარის გარემოზე, რომელიც შეიცავს 200 μM KAND ან DMSO.თამბაქოს თესლები გაშენებული იყო ზრდის პალატაში და გაღივებული ნერგების რაოდენობა დათვლილი იყო 14 დღის შემდეგ.ღვიძლის რძის ზრდის დათრგუნვის ანალიზისთვის, თითოეული ფირფიტიდან 9 ემბრიონი მოთავსდა აგარის გარემოზე, რომელიც შეიცავს KAND ან DMSO მითითებულ კონცენტრაციებს და ინკუბირებული იყო ზრდის პალატაში 14 დღის განმავლობაში.
ფესვის მერისტემის ორგანიზაციის ვიზუალიზაციისთვის გამოიყენეთ 5 მგ/მლ პროპიდიუმის იოდიდით (PI) შეღებილი ნერგები.PI სიგნალები დაფიქსირდა ფლუორესცენტული მიკროსკოპით TCS SPE კონფოკალური ლაზერული სკანირების მიკროსკოპის გამოყენებით (Leica Microsystems).
ფესვების ჰისტოქიმიური შეღებვა β-გლუკურონიდაზათ (GUS) განხორციელდა მალამის და ბენფეის36 მიერ აღწერილი პროტოკოლის მიხედვით.ნერგები დაფიქსირდა 90%-იან აცეტონში მთელი ღამის განმავლობაში, შეღებეს 0,5 მგ/მლ 5-ბრომო-4-ქლორო-3-ინდოლილ-β-d-გლუკურონის მჟავით GUS ბუფერში 1 საათის განმავლობაში და მოათავსეს ჰიდრატირებულ ქლორალდეჰიდის ხსნარში.(8 გ ქლორალის ჰიდრატი, 2 მლ წყალი და 1 მლ გლიცეროლი) და დაკვირვება დიფერენციალური ჩარევის კონტრასტული მიკროსკოპით Axio Imager M1 მიკროსკოპის გამოყენებით (Carl Zeiss).
ფესვის კუთხეები გაზომეს ვერტიკალურად განლაგებულ ფირფიტებზე გაზრდილ 7 დღის ნერგებზე.გაზომეთ ფესვის კუთხე სიმძიმის ვექტორის მიმართულებიდან, როგორც ეს აღწერილია მე-6 საფეხურში.
კორტიკალური მიკროტუბულების განლაგება დაფიქსირდა, როგორც აღწერილია, პროტოკოლის მცირე ცვლილებებით 37 .ანტი β-ტუბულინის ანტისხეული (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) და Alexa Fluor 488-კონიუგირებული თაგვის საწინააღმდეგო IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) გამოიყენებოდა როგორც პირველადი და მეორადი ანტისხეულები 1:1000 და 1:100 განზავების დროს. შესაბამისად.ფლუორესცენციის გამოსახულებები შეძენილი იქნა TCS SPE კონფოკალური ლაზერული სკანირების მიკროსკოპის გამოყენებით (Leica Microsystems).შეიძინეთ Z-სტაკის სურათები და შექმენით მაქსიმალური ინტენსივობის პროგნოზები მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით.
HeLa უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზი ჩატარდა Cell Counting Kit 8 (Dojindo) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით.
E. coli DH5α ზრდა გაანალიზდა უჯრედის სიმკვრივის გაზომვით კულტურაში სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით 600 ნმ (OD600).
ციტოჩონჩხის ორგანიზაცია ტრანსგენურ BY-2 უჯრედებში დაფიქსირდა ფლუორესცენტული მიკროსკოპის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო CSU-X1 კონფოკალური სკანირების მოწყობილობით (Yokogawa) და sCMOS კამერით (Zyla, Andor Technology).ციტოჩონჩხის სიმკვრივე შეფასდა გამოსახულების ანალიზით, რომელიც რაოდენობრივად ადგენდა ციტოჩონჩხის პიქსელების პროცენტს ციტოპლაზმურ პიქსელებს შორის კონფოკალურ სურათებში ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით, როგორც აღწერილია38,39.
BY-2 უჯრედებში უჯრედის სიკვდილის დასადგენად, უჯრედის სუსპენზიის ალიქვოტი ინკუბირებული იყო 0.05% ევანსის ლურჯით 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.მკვდარი უჯრედების შერჩევითი ევანსის ლურჯი შეღებვა დამოკიდებულია სიცოცხლისუნარიანი უჯრედებიდან საღებავის ექსტრუზიაზე ხელუხლებელი პლაზმური მემბრანის მიერ40.შეღებილი უჯრედები დაფიქსირდა ნათელი ველის მიკროსკოპის გამოყენებით (BX53, Olympus).
HeLa უჯრედები გაიზარდა DMEM-ში, რომელსაც დაემატა 10% FBS დატენიანებულ ინკუბატორში 37°C და 5% CO2.უჯრედები დამუშავდა 100 μM KAND 11, კუმამონამის მჟავა 6, კუმამონამიდი 1, 100 ნგ/მლ კოლცემიდი (გიბკო) ან 100 ნგ/მლ ნოკოდმაზი (სიგმა) 6 საათის განმავლობაში 37°C-ზე.უჯრედები დაფიქსირდა MetOH-ით 10 წუთის განმავლობაში და შემდეგ აცეტატით 5 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.ფიქსირებული უჯრედები ინკუბირებული იყო β-ტუბულინის პირველადი ანტისხეულით (1D4A4, Proteintech: 66240-1) განზავებული 0.5% BSA/PBS-ში 2 საათის განმავლობაში, გარეცხილი 3-ჯერ TBST-ით და შემდეგ ინკუბირებული იყო Alexa Fluor-ის თხის ანტისხეულით.488 1 საათი.– თაგვის IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) და 15 ნგ/მლ 4′,6-დიამიდინო-2-ფენილინდოლი (DAPI) განზავებული 0.5% BSA/PBS-ში.TBST-ით სამჯერ დაბანის შემდეგ, შეღებილი უჯრედები დაფიქსირდა Nikon Eclipse Ti-E ინვერსიულ მიკროსკოპზე.სურათები გადაღებულია გაცივებული Hamamatsu ORCA-R2 CCD კამერით MetaMorph პროგრამული უზრუნველყოფის (Molecular Devices) გამოყენებით.