ურსას მონოამიდების, როგორც მცენარეთა მიკროტუბულებზე მოქმედი ახალი ზრდის ინჰიბიტორების, აღმოჩენა, დახასიათება და ფუნქციური გაუმჯობესება.

გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებული ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის მხარდაჭერა შეზღუდული აქვს. საუკეთესო შედეგის მისაღწევად, გირჩევთ, გამოიყენოთ თქვენი ბრაუზერის უფრო ახალი ვერსია (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, საიტს სტილის ან JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
ბუნებრივი პროდუქტების აღმოჩენამ და სასარგებლო გამოყენებამ შეიძლება ხელი შეუწყოს ადამიანის ცხოვრების გაუმჯობესებას. მცენარეთა ზრდის ინჰიბიტორული ქიმიკატები ფართოდ გამოიყენება ჰერბიციდების სახით სარეველების კონტროლისთვის. სხვადასხვა ტიპის ჰერბიციდების გამოყენების აუცილებლობის გამო, საჭიროა მოქმედების ახალი მექანიზმების მქონე ნაერთების იდენტიფიცირება. ამ კვლევაში, ჩვენ აღმოვაჩინეთ ახალი N-ალკოქსიპიროლის ნაერთი, კუმამონამიდი, Streptomyces werraensis MK493-CF1-დან და დავამკვიდრეთ სრული სინთეზის პროცესი. ბიოლოგიური აქტივობის ანალიზების საშუალებით აღმოვაჩინეთ, რომ ურს-მონოამიდის მჟავა არის ურს-მონოამიდის სინთეზური შუალედური პროდუქტი და პოტენციური...მცენარის ზრდის ინჰიბიტორიგარდა ამისა, ჩვენ შევიმუშავეთ ურბენონის მჟავას სხვადასხვა წარმოებულები, მათ შორის ურბენილოქსის წარმოებული (UDA), რომელსაც აქვს მაღალი ჰერბიციდური აქტივობა HeLa უჯრედების ზრდაზე უარყოფითი გავლენის გარეშე. ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ურმოტონური მჟავას წარმოებულები არღვევენ მცენარის მიკროტუბულებს; გარდა ამისა, KAND გავლენას ახდენს აქტინის ძაფებზე და იწვევს უჯრედების სიკვდილს; ეს მრავალმხრივი ეფექტები განსხვავდება ცნობილი მიკროტუბულების ინჰიბიტორებისგან და მიუთითებს ურბენონის მჟავას მოქმედების ახალ მექანიზმზე, რაც მნიშვნელოვან უპირატესობას წარმოადგენს ახალი ჰერბიციდების შემუშავებაში.
სასარგებლო ბუნებრივი პროდუქტებისა და მათი წარმოებულების აღმოჩენა და პრაქტიკული გამოყენება ადამიანის ცხოვრების ხარისხის გაუმჯობესების საშუალებაა. მიკროორგანიზმების, მცენარეებისა და მწერების მიერ წარმოქმნილმა მეორადმა მეტაბოლიტებმა მედიცინასა და სოფლის მეურნეობაში მნიშვნელოვანი პროგრესი გამოიწვია. ბუნებრივი პროდუქტებისგან შემუშავდა მრავალი ანტიბიოტიკი და ლეიკემიის საწინააღმდეგო პრეპარატი. გარდა ამისა, სხვადასხვა სახისპესტიციდები, ამ ბუნებრივი პროდუქტებიდან მიიღება ფუნგიციდები და ჰერბიციდები სოფლის მეურნეობაში გამოსაყენებლად. კერძოდ, სარეველების კონტროლის ჰერბიციდები მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტებია თანამედროვე სოფლის მეურნეობაში მოსავლიანობის გაზრდისთვის და სხვადასხვა ტიპის ნაერთები უკვე გამოიყენება კომერციულად. მცენარეებში რამდენიმე უჯრედული პროცესი, როგორიცაა ფოტოსინთეზი, ამინომჟავების მეტაბოლიზმი, უჯრედის კედლის სინთეზი, მიტოზის რეგულირება, ფიტოჰორმონის სიგნალიზაცია ან ცილის სინთეზი, ჰერბიციდების ტიპურ სამიზნეებად ითვლება. მიკრომილაკების ფუნქციის დამთრგუნველი ნაერთები ჰერბიციდების გავრცელებული კლასია, რომლებიც გავლენას ახდენენ მცენარის ზრდაზე მიტოზურ რეგულირებაზე ზემოქმედებით2.
მიკრომილაკები ციტოჩონჩხის კომპონენტებია და ფართოდ არის დაცული ეუკარიოტულ უჯრედებში. ტუბულინის ჰეტეროდიმერი შედგება α-ტუბულინისა და β-ტუბულინისგან, რომლებიც ქმნიან ხაზოვან მიკრომილაკების პროტოფილამენტებს, რომელთაგან 13 პროტოფილამენტი ქმნის ცილინდრულ სტრუქტურას. მიკრომილაკები მრავალ როლს ასრულებენ მცენარეთა უჯრედებში, მათ შორის უჯრედის ფორმის, უჯრედის გაყოფისა და უჯრედშიდა ტრანსპორტის განსაზღვრაში3,4. მცენარეული უჯრედები შეიცავს მიკრომილაკებს ფაზათაშორისი პლაზმური მემბრანის ქვეშ და, სავარაუდოდ, ეს ე.წ. კორტიკალური მიკრომილაკები აკონტროლებენ ცელულოზის მიკროფიბრილების ორგანიზაციას ცელულოზის სინთაზას კომპლექსების რეგულირების გზით4,5. ფესვის ეპიდერმული უჯრედების კორტიკალური მიკრომილაკები, რომლებიც ფესვის წვერის სწრაფი დაგრძელების ზონაშია, განლაგებულია ლატერალურად და ცელულოზის მიკროფიბრები მიჰყვებიან ამ მიკრომილაკებს და ზღუდავენ უჯრედების გაფართოების მიმართულებას, რითაც ხელს უწყობენ ანიზოტროპული უჯრედების დაგრძელებას. ამიტომ, მიკრომილაკების ფუნქცია მჭიდრო კავშირშია მცენარის მორფოლოგიასთან. ტუბულინის კოდირების გენებში ამინომჟავების ჩანაცვლება იწვევს კორტიკალური მიკრომილაკების მასივების დამახინჯებას და მარცხენა ან მარჯვენა მხარეს ზრდას Arabidopsis-ში 6,7. ანალოგიურად, მიკრომილაკებთან ასოცირებული ცილების მუტაციებმა, რომლებიც არეგულირებენ მიკრომილაკების დინამიკას, ასევე შეიძლება გამოიწვიოს ფესვების ზრდის დარღვევა8,9,10,11,12,13. გარდა ამისა, მიკრომილაკების დამრღვევი ჰერბიციდებით, როგორიცაა დიზოპირამიდი, ასევე ცნობილი როგორც პრეტილაქლორი, დამუშავება ასევე იწვევს მარცხენა მხარეს ირიბ ფესვის ზრდას14. ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ მიკრომილაკების ფუნქციის ზუსტი რეგულირება კრიტიკულად მნიშვნელოვანია მცენარის ზრდის მიმართულების დასადგენად.
აღმოჩენილია მიკრომილაკების ინჰიბიტორების სხვადასხვა ტიპი და ამ პრეპარატებმა მნიშვნელოვანი წვლილი შეიტანეს ციტოჩონჩხის კვლევაში, ასევე სოფლის მეურნეობასა და მედიცინაში2. კერძოდ, ორიზალინს, დინიტროანილინის ნაერთებს, დიზოპირამიდს, ბენზამიდთან დაკავშირებულ ნაერთებს და მათ ანალოგებს შეუძლიათ მიკრომილაკების ფუნქციის დათრგუნვა და ამით მცენარის ზრდის შეფერხება. ამიტომ, ისინი ფართოდ გამოიყენება ჰერბიციდების სახით. თუმცა, რადგან მიკრომილაკები მცენარეული და ცხოველური უჯრედების მნიშვნელოვანი კომპონენტია, მიკრომილაკების ინჰიბიტორების უმეტესობა ციტოტოქსიკურია ორივე ტიპის უჯრედისთვის. ამიტომ, მიუხედავად მათი აღიარებული გამოყენებისა, როგორც ჰერბიციდების, პრაქტიკული მიზნებისთვის გამოიყენება ანტიმიკრომილაკების შეზღუდული რაოდენობა.
Streptomyces წარმოადგენს Streptomyces ოჯახის გვარს, რომელიც მოიცავს აერობულ, გრამდადებით, ძაფისებრ ბაქტერიებს და ფართოდ არის ცნობილი მეორადი მეტაბოლიტების ფართო სპექტრის წარმოქმნის უნარით. ამიტომ, იგი ითვლება ახალი ბიოლოგიურად აქტიური ბუნებრივი პროდუქტების ერთ-ერთ უმნიშვნელოვანეს წყაროდ. ამ კვლევაში აღმოვაჩინეთ ახალი ნაერთი, სახელწოდებით კუმამონამონამიდი, რომელიც გამოყოფილი იქნა Streptomyces werraensis MK493-CF1-დან და S. werraensis ISP 5486-დან. სპექტრული ანალიზისა და სრული სპექტრული ანალიზის გამოყენებით დახასიათდა კუმამონამოდის სტრუქტურა და განისაზღვრა მისი უნიკალური N-ალკოქსიპიროლის ჩონჩხი. სინთეზი. აღმოჩნდა, რომ ურსმონომის მჟავა, ურსმონომის მჟავა და მისი წარმოებულების სინთეზური შუალედური პროდუქტი, აფერხებს პოპულარული მოდელის მცენარის, Arabidopsis thaliana-ს, ზრდას და აღმოცენებას. სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის კვლევაში აღმოვაჩინეთ, რომ C9-ით მოდიფიცირებული ნაერთი, რომელსაც ურსონის მჟავას ნონილოქსი წარმოებული (KAND) ეწოდება, მნიშვნელოვნად აძლიერებს ზრდასა და აღმოცენებაზე დამთრგუნველ ეფექტს. აღსანიშნავია, რომ ახლად აღმოჩენილი მცენარის ზრდის ინჰიბიტორი ასევე მოქმედებდა თამბაქოსა და ღვიძლის ფოთლის ზრდაზე და არ იყო ციტოტოქსიკური ბაქტერიების ან HeLa უჯრედებისთვის. გარდა ამისა, ურმოტონური მჟავის ზოგიერთი წარმოებული იწვევს ფესვის ფენოტიპის დამახინჯებას, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ეს წარმოებულები პირდაპირ ან ირიბად მოქმედებენ მიკრომილაკებზე. ამ იდეასთან შესაბამისობაში, იმუნოჰისტოქიმიურად ან ფლუორესცენტური ცილებით მონიშნული მიკრომილაკების ჩვენი დაკვირვებები მიუთითებს, რომ KAND დამუშავება დეპოლიმერიზირებს მიკრომილაკებს. გარდა ამისა, კუმამოტონური მჟავის წარმოებულებით დამუშავებამ დაარღვია აქტინის მიკროფილამენტები. ამრიგად, ჩვენ აღმოვაჩინეთ მცენარის ზრდის ახალი ინჰიბიტორი, რომლის მოქმედების უნიკალური მექანიზმი გულისხმობს ციტოჩონჩხის განადგურებას.
შტამი MK493-CF1 იზოლირებული იქნა ნიადაგიდან შინაგავა-კუში, ტოკიოში. შტამი MK493-CF1 წარმოქმნიდა კარგად განშტოებულ სტრომულ მიცელიუმს. განისაზღვრა 16S რიბოსომული რნმ გენის ნაწილობრივი თანმიმდევრობა (1422 bp). ეს შტამი ძალიან ჰგავს S. werraensis-ს (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ტიპიური შტამი, 99.93%). ამ შედეგის საფუძველზე დადგინდა, რომ ეს შტამი მჭიდროდ ენათესავება S. werraensis-ის ტიპურ შტამს. ამიტომ, ჩვენ პირობითად დავარქვით ამ შტამს S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T ასევე წარმოქმნის იგივე ბიოაქტიურ ნაერთებს. რადგან ამ მიკროორგანიზმიდან ბუნებრივი პროდუქტების მიღების ადრეული კვლევა მცირე იყო, ჩატარდა შემდგომი ქიმიური კვლევა. S. werraensis MK493-CF1-ის ქერის გარემოზე 30°C ტემპერატურაზე მყარი მდგომარეობის დუღილის მეთოდით 14 დღის განმავლობაში კულტივირების შემდეგ, გარემო ექსტრაგირებული იქნა 50%-იანი EtOH-ით. ნიმუშის 60 მლ გაშრა 59.5 მგ ნედლი ექსტრაქტის მისაღებად. ნედლი ექსტრაქტი დაექვემდებარა უკუფაზურ HPLC-ს N-მეტოქსი-1H-პიროლ-2-კარბოქსამიდის (1, სახელწოდებით კუმამონამიდი, 36.0 მგ) მისაღებად. 1-ის საერთო რაოდენობა ნედლი ექსტრაქტის დაახლოებით 60%-ს შეადგენს. ამიტომ, ჩვენ გადავწყვიტეთ, დეტალურად შეგვესწავლა კუმამოტოამიდი 1-ის თვისებები.
კუმამონამიდი 1 არის თეთრი ამორფული ფხვნილი და მაღალი გარჩევადობის მას-სპექტრომეტრია (HRESIMS) ადასტურებს C6H8N2O2-ს (სურ. 1). ამ ნაერთის C2-ჩანაცვლებული პიროლის ფრაგმენტი ხასიათდება δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR სპექტრში: 4.5 Hz, H-5) და δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) მაჩვენებლებით, ხოლო 13C NMR სპექტრი აჩვენებს ოთხი sp2 ნახშირბადის ატომის არსებობას. ამიდური ჯგუფის არსებობა C2 პოზიციაზე შეფასდა HMBC კორელაციით C-3 პროტონიდან ამიდ კარბონილის ნახშირბადთან δC 161.1-ზე. გარდა ამისა, 1H და 13C NMR პიკები δH 4.10 (3H, S) და δC 68.3-ზე მიუთითებს მოლეკულაში N-მეტოქსი ჯგუფების არსებობაზე. მიუხედავად იმისა, რომ მეტოქსი ჯგუფის სწორი მდებარეობა ჯერ არ იყო განსაზღვრული სპექტროსკოპიული ანალიზის გამოყენებით, როგორიცაა გაძლიერებული სხვაობის სპექტროსკოპია და ბირთვული ოვერჰაუზერის აბრევიატურა (NOEDF), N-მეტოქსი-1H-პიროლ-2-კარბოქსამიდი გახდა პირველი კანდიდატი ნაერთი.
1-ის სწორი სტრუქტურის დასადგენად, ჩატარდა სრული სინთეზი (სურ. 2ა). კომერციულად ხელმისაწვდომი 2-ამინოპირიდინ 2-ის m-CPBA-თი დამუშავების შედეგად მიღებულ იქნა შესაბამისი N-ოქსიდი 3 რაოდენობრივი გამოსავლიანობით. 2-ის 2-ამინოაზიდაციის შემდეგ, აბრამოვიჩის მიერ აღწერილი ციკლოკონდენსაციის რეაქცია ჩატარდა ბენზოლში 90°C-ზე, სასურველი 1-ჰიდროქსი-1H-პიროლ-2-კარბონიტრილი 5 გრამებში მისაღებად. სიჩქარე 60% (ორი ეტაპი). 15,16. 4-ის მეთილირებისა და ჰიდროლიზის შედეგად მიღებული იქნა 1-მეტოქსი-1H-პიროლ-2-კარბოქსილის მჟავა (რომელსაც „კუმოტონური მჟავა“ ეწოდება, 6) კარგი გამოსავლიანობით (70%, ორი ეტაპი). და ბოლოს, ამიდაციამ მჟავა ქლორიდის შუალედური ნაერთის 6 მეშვეობით წყალხსნარი ამიაკის გამოყენებით მოგვცა კუმამოტოს ამიდი 1 98%-იანი გამოსავლიანობით. სინთეზირებული 1-ის ყველა სპექტრული მონაცემი მსგავსი იყო იზოლირებული 1-ის, ამიტომ განისაზღვრა 1-ის სტრუქტურა;
ურბენამიდისა და ურბენის მჟავას ბიოლოგიური აქტივობის ზოგადი სინთეზი და ანალიზი. (ა) კუმამოტოს ამიდის სრული სინთეზი. (ბ) შვიდი დღის ველური ტიპის Arabidopsis Columbia (Col) ნერგები გაიზარდა მურაშიგესა და სკუგის (MS) ფირფიტებზე, რომლებიც შეიცავდნენ კუმამონამიდ 6-ს ან კუმამონამიდ 1-ს მითითებული კონცენტრაციით. შკალის ზოლი = 1 სმ.
პირველ რიგში, ჩვენ შევაფასეთ ურბენამიდის და მისი შუალედური პროდუქტების ბიოლოგიური აქტივობა მცენარის ზრდის მოდულირების უნარის დასადგენად. MS აგარის გარემოში დავამატეთ ურსმონამიდი 1-ის ან ურსმონის მჟავა 6-ის სხვადასხვა კონცენტრაცია და ამ გარემოში Arabidopsis thaliana-ს ნერგები დავაკულტივეთ. ამ ანალიზებმა აჩვენა, რომ 6-ის მაღალი კონცენტრაციები (500 μM) აფერხებდა ფესვის ზრდას (სურ. 2b). შემდეგ, 6-ის N1 პოზიციის ჩანაცვლებით მივიღეთ სხვადასხვა წარმოებულები და ჩავატარეთ მათზე სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის კვლევები (ანალოგური სინთეზის პროცესი აღწერილია დამატებით ინფორმაციაში (SI)). Arabidopsis-ის ნერგები გაიზარდა გარემოზე, რომელიც შეიცავდა 50 μM ურსონის მჟავას წარმოებულებს და გაიზომა ფესვის სიგრძე, როგორც ეს ნაჩვენებია სურათზე. როგორც ნაჩვენებია სურათებზე 3a, b და S1, კუმამოს მჟავებს აქვთ ხაზოვანი ალკოქსი ჯაჭვების (9, 10, 11, 12 და 13) ან დიდი ალკოქსი ჯაჭვების (15, 16 და 17) სხვადასხვა სიგრძე N1 პოზიციაზე. წარმოებულებმა ფესვის ზრდის მნიშვნელოვანი ინჰიბირება აჩვენეს. გარდა ამისა, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 200 μM 10, 11 ან 17-ის გამოყენებამ აღმოცენება შეაფერხა (სურ. 3c და S2).
კუმამოტოს ამიდისა და მასთან დაკავშირებული ნაერთების სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის შესწავლა. (ა) ანალოგების სტრუქტურა და სინთეზის სქემა. (ბ) 7 დღის ნერგების ფესვის სიგრძის რაოდენობრივი განსაზღვრა, რომლებიც გაზრდილია MS გარემოში 50 μM კუმამონამიდის წარმოებულებით ან მის გარეშე. ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე ფიქტიური დამუშავების დროს (t ტესტი, p< 0.05). n>18. მონაცემები მოცემულია საშუალო ± სტანდარტული გადახრით. nt ნიშნავს „არ არის შემოწმებული“, რადგან თესლის 50%-ზე მეტი არ აღმოცენდა. (გ) დამუშავებული თესლის აღმოცენების სიჩქარის რაოდენობრივი განსაზღვრა, რომელიც 7 დღის განმავლობაში ინკუბირებული იყო MS გარემოში 200 μM კუმამონამიდით და მასთან დაკავშირებული ნაერთებით ან მის გარეშე. ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე ფიქტიური დამუშავების დროს (ქი-კვადრატის ტესტი). n=96.
საინტერესოა, რომ C9-ზე გრძელი ალკილის გვერდითი ჯაჭვების დამატებამ შეამცირა ინჰიბიტორული აქტივობა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ კუმამოტოის მჟავასთან დაკავშირებულ ნაერთებს ბიოლოგიური აქტივობის გამოსავლენად გარკვეული ზომის გვერდითი ჯაჭვები სჭირდებათ.
რადგან სტრუქტურა-აქტივობის ურთიერთობის ანალიზმა აჩვენა, რომ C9 მოდიფიცირებული იყო ურსონის მჟავად და ურსონის მჟავას ნონილოქსი წარმოებული (შემდგომში KAND 11) იყო მცენარის ზრდის ყველაზე ეფექტური ინჰიბიტორი, ჩვენ ჩავატარეთ KAND 11-ის უფრო დეტალური დახასიათება. Arabidopsis-ის 50 μM KAND 11-ით დამუშავებამ თითქმის მთლიანად შეაჩერა აღმოცენება, მაშინ როდესაც KAND 11-ის უფრო დაბალმა კონცენტრაციებმა (40, 30, 20 ან 10 μM) დოზადამოკიდებული გზით შეაფერხა ფესვის ზრდა (სურ. 4ა, ბ). იმის შესამოწმებლად, მოქმედებს თუ არა KAND 11 ფესვის მერისტემის სიცოცხლისუნარიანობაზე, ჩვენ გამოვიკვლიეთ პროპიდიუმის იოდიდით (PI) შეღებილი ფესვის მერისტემები და გავზომეთ მერისტემის ფართობის ზომა. 25 μM KAND-11-ის შემცველ გარემოზე გაზრდილი ნერგების მერისტემის ზომა იყო 151.1 ± 32.5 μm, ხოლო DMSO-ს შემცველ საკონტროლო გარემოზე გაზრდილი ნერგების მერისტემის ზომა იყო 264.7 ± 30.8 μm (სურ. 4c, d), რაც მიუთითებს, რომ KAND-11 აღადგენს უჯრედულ აქტივობას. გავრცელება. ფესვის მერისტემა. ამასთან შესაბამისობაში, KAND 11-ით დამუშავებამ შეამცირა უჯრედის გაყოფის მარკერის CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS სიგნალის რაოდენობა ფესვის მერისტემაში (სურ. 4e)17. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ KAND 11 აფერხებს ფესვის ზრდას უჯრედების პროლიფერაციის აქტივობის შემცირებით.
ურბენონის მჟავას წარმოებულების (ურბენილოქსი წარმოებულების) ზრდაზე ინჰიბიტორული ეფექტის ანალიზი. (ა) 7 დღის ველური ტიპის Col ნერგები, რომლებიც გაზრდილია MS ფირფიტებზე KAND 11-ის მითითებული კონცენტრაციებით. მასშტაბის ზოლი = 1 სმ. (ბ) ფესვის სიგრძის რაოდენობრივი განსაზღვრა. ასოები აღნიშნავს მნიშვნელოვან განსხვავებებს (Tukey HSD ტესტი, გვ.< 0.05). n>16. მონაცემები ნაჩვენებია საშუალო ± სტანდარტული გადახრით. (გ) პროპიდიუმის იოდიდით შეღებილი ველური ტიპის Col ფესვების კონფოკალური მიკროსკოპია, რომლებიც გაზრდილია MS ფირფიტებზე 25 μM KAND 11-ით ან მის გარეშე. თეთრი ფრჩხილები მიუთითებს ფესვის მერისტემაზე. მასშტაბის ზოლი = 100 µm. (დ) ფესვის მერისტემის ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 10-დან 11-მდე). სტატისტიკური განსხვავებები განისაზღვრა t-ტესტის გამოყენებით (p< 0.05). სვეტები წარმოადგენს მერისტემის საშუალო ზომას. (ე) CDKB2 კონსტრუქტის შემცველი ფესვის მერისტემის დიფერენციალური ინტერფერენციული კონტრასტის (DIC) მიკროსკოპია; 1pro: CDKB2; 1-GUS შეღებილი და შეღებილი 5 დღის ნერგებზე, რომლებიც გაზრდილნი არიან MS ფირფიტებზე 25 µM KAND ანალიზით ან მის გარეშე.
KAND 11-ის ფიტოტოქსიკურობა დამატებით შემოწმდა კიდევ ერთი ორტილედონური მცენარის, თამბაქოს (Nicotiana tabacum) და ხმელეთის მცენარის ძირითადი მოდელის ორგანიზმის, ღვიძლის სპირტის (Marchantia polymorpha) გამოყენებით. როგორც Arabidopsis-ის შემთხვევაში, თამბაქოს SR-1 ნერგებმა, რომლებიც გაზრდილ იქნა 25 μM KAND 11-ის შემცველ გარემოზე, უფრო მოკლე ფესვები გამოიღო (სურ. 5ა). გარდა ამისა, 48 თესლიდან 40 აღმოცენდა 200 μM KAND 11-ის შემცველ ფირფიტებზე, მაშინ როდესაც 48-ვე თესლი აღმოცენდა საცდელ გარემოზე, რაც მიუთითებს, რომ KAND-ის უფრო მაღალი კონცენტრაციები მნიშვნელოვანი იყო (p< 0.05; chi test -square) აფერხებდა თამბაქოს აღმოცენებას. (სურ. 5ბ). გარდა ამისა, KAND 11-ის კონცენტრაცია, რომელიც აფერხებდა ბაქტერიების ზრდას ღვიძლის ვორტში, მსგავსი იყო Arabidopsis-ის ეფექტური კონცენტრაციისა (სურ. 5გ). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ KAND 11-ს შეუძლია შეაფერხოს სხვადასხვა მცენარის ზრდა. შემდეგ ჩვენ გამოვიკვლიეთ დათვის მონოამიდთან დაკავშირებული ნაერთების შესაძლო ციტოტოქსიკურობა სხვა ორგანიზმებში, კერძოდ, ადამიანის HeLa უჯრედებსა და Escherichia coli შტამ DH5α-ში, როგორც უმაღლესი ცხოველების და ბაქტერიული უჯრედების წარმომადგენლებში, შესაბამისად. უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზების სერიაში ჩვენ დავაკვირდით, რომ კუმამონამიდი 1, კუმამონამიდის მჟავა 6 და KAND 11 არ ახდენდნენ გავლენას HeLa ან E. coli უჯრედების ზრდაზე 100 μM კონცენტრაციით (სურ. 5დ,ე).
KAND 11-ის ზრდის ინჰიბირება არა-Arabidopsis ორგანიზმებში. (ა) ორკვირიანი ველური ტიპის SR-1 თამბაქოს ნერგები გაიზარდა ვერტიკალურად განლაგებულ MS ფირფიტებზე, რომლებიც შეიცავდა 25 μM KAND 11-ს. (ბ) ორკვირიანი ველური ტიპის SR-1 თამბაქოს ნერგები გაიზარდა ჰორიზონტალურად განლაგებულ MS ფირფიტებზე, რომლებიც შეიცავდა 200 μM KAND 11-ს. (გ) ორკვირიანი ველური ტიპის Tak-1 ღვიძლის კვირტები, რომლებიც გაზრდილია Gamborg B5 ფირფიტებზე KAND 11-ის მითითებული კონცენტრაციებით. წითელი ისრები მიუთითებს სპორებზე, რომლებმაც შეწყვიტეს ზრდა ორკვირიანი ინკუბაციის პერიოდში. (დ) HeLa უჯრედების უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზი. სიცოცხლისუნარიანი უჯრედების რაოდენობა გაიზომა ფიქსირებული დროის ინტერვალებით უჯრედების დათვლის ნაკრები 8-ის (Dojindo) გამოყენებით. კონტროლის სახით, HeLa უჯრედები დამუშავდა 5 μg/მლ აქტინომიცინით D-ით (Act D), რომელიც აფერხებს რნმ პოლიმერაზას ტრანსკრიფციას და იწვევს უჯრედების სიკვდილს. ანალიზები ჩატარდა სამჯერ. (ე) E. coli უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზი. E. coli-ს ზრდა გაანალიზდა OD600-ის გაზომვით. კონტროლის სახით, უჯრედები დამუშავდა 50 მკგ/მლ ამპიცილინით (Amp), რომელიც აფერხებს ბაქტერიული უჯრედის კედლის სინთეზს. ანალიზები ჩატარდა სამჯერ.
ურამიდთან დაკავშირებული ნაერთებით გამოწვეული ციტოტოქსიკურობის მოქმედების მექანიზმის გასაშიფრად, ჩვენ ხელახლა გავაანალიზეთ ურბენის მჟავას წარმოებულები ზომიერი ინჰიბიტორული ეფექტით, როგორც ეს ნაჩვენებია სურათზე. როგორც ნაჩვენებია სურათებზე 2b, 6a, ურმოტონის მჟავას 6 მაღალი კონცენტრაციის (200 μM) შემცველ აგარის ფირფიტებზე გაზრდილმა ნერგებმა უფრო მოკლე და მარცხნივ მოხრილი ფესვები გამოიღეს (θ = – 23.7 ± 6.1), მაშინ როდესაც საკონტროლო გარემოზე გაზრდილ ნერგებს თითქმის სწორი ფესვები გამოუვიდათ (θ = – 3.8 ± 7.1). ცნობილია, რომ ეს დამახასიათებელი ირიბი ზრდა კორტიკალური მიკროტუბულების დისფუნქციის შედეგია14,18. ამ დასკვნასთან შესაბამისობაში, მიკროტუბულების დესტაბილიზაციის პრეპარატებმა დიზოპირამიდმა და ორიზალინმა ჩვენი ზრდის პირობებში ფესვების მსგავსი დახრა გამოიწვია (სურ. 2b, 6a). ამავდროულად, ჩვენ გამოვცადეთ ურმოტონის მჟავას წარმოებულები და შევარჩიეთ რამდენიმე მათგანი, რომლებიც გარკვეული კონცენტრაციით იწვევდნენ ირიბ ფესვების ზრდას. ნაერთებმა 8, 9 და 15 შეცვალეს ფესვის ზრდის მიმართულება შესაბამისად 75 μM, 50 μM და 40 μM-ზე, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ამ ნაერთებს შეუძლიათ ეფექტურად დესტაბილიზაცია მოახდინონ მიკრომილაკების მიმართ (სურ. 2b, 6a). ჩვენ ასევე გამოვცადეთ ყველაზე ძლიერი ურსოლის მჟავას წარმოებული, KAND 11, უფრო დაბალი კონცენტრაციით (15 μM) და აღმოვაჩინეთ, რომ KAND 11-ის გამოყენება აფერხებდა ფესვის ზრდას და რომ ფესვის ზრდის მიმართულება არათანაბარი იყო, თუმცა ისინი მიდრეკილნი იყვნენ მარცხნივ გადახრისკენ (სურათი C3). რადგან მიკრომილაკების დესტაბილიზაციის უფრო მაღალი კონცენტრაციები ზოგჯერ აფერხებს მცენარის ზრდას და არა იწვევს ფესვის დახრას, შემდგომში შევაფასეთ იმის შესაძლებლობა, რომ KAND 11 გავლენას ახდენს მიკრომილაკებზე ფესვის ეპიდერმულ უჯრედებში კორტიკალური მიკრომილაკების დაკვირვებით. იმუნოჰისტოქიმიამ, რომელიც იყენებდა ანტი-β-ტუბულინის ანტისხეულებს 25 μM KAND 11-ით დამუშავებული ნერგების ფესვების ეპიდერმულ უჯრედებში, აჩვენა თითქმის ყველა კორტიკალური მიკრომილაკების გაქრობა ეპიდერმულ უჯრედებში წაგრძელების ზონაში (სურ. 6b). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ კუმამოტონის მჟავა და მისი წარმოებულები პირდაპირ ან ირიბად მოქმედებენ მიკრომილაკებზე, არღვევენ მათ და რომ ეს ნაერთები მიკრომილაკების ახალი ინჰიბიტორებია.
ურსონის მჟავა და მისი წარმოებულები ცვლიან Arabidopsis thaliana-ს კორტიკალურ მიკრომილაკებს. (ა) ფესვის დახრილობის კუთხე, გაზომილი სხვადასხვა ურმოტონის მჟავას წარმოებულების თანაარსებობისას მითითებულ კონცენტრაციებში. ასევე გაანალიზდა ორი ნაერთის - დიზოპირამიდისა და ორიზალინის - ეფექტები, რომლებიც ცნობილია მიკრომილაკების ინჰიბირებით. ჩანართში ნაჩვენებია სტანდარტი, რომელიც გამოიყენება ფესვის ზრდის კუთხის გასაზომად. ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე ფიქტიური დამუშავებისგან (t ტესტი, p< 0.05). n>19. მასშტაბის ზოლი = 1 სმ. (ბ) ეპიდერმულ უჯრედებში კორტიკალური მიკროტუბულები წაგრძელების ზონაში. ველური ტიპის Arabidopsis Col-ის ფესვებში მიკროტუბულები, რომლებიც გაიზარდა MS ფირფიტებზე 25 μM KAND 11-ით ან მის გარეშე, ვიზუალიზებული იქნა იმუნოჰისტოქიმიური შეღებვით β-ტუბულინის პირველადი ანტისხეულების და Alexa Fluor-თან კონიუგირებული მეორადი ანტისხეულების გამოყენებით. მასშტაბის ზოლი = 10 µm. (გ) მიკროტუბულების მიტოზური სტრუქტურა ფესვის მერისტემაში. მიკროტუბულები ვიზუალიზებული იქნა იმუნოჰისტოქიმიური შეღებვის გამოყენებით. მიტოზური სტრუქტურები, მათ შორის პროფაზის ზონები, თითისტარები და ფრაგმოპლასტები, დაითვალა კონფოკალური სურათებიდან. ისრები მიუთითებს მიტოზურ მიკროტუბულურ სტრუქტურებზე. ვარსკვლავი მიუთითებს მნიშვნელოვან განსხვავებებზე ფიქტიური დამუშავებით (t ტესტი, p< 0.05). n>9. მასშტაბის ზოლი = 50 µმ.
მიუხედავად იმისა, რომ ურსას აქვს მიკრომილაკების ფუნქციის დარღვევის უნარი, მისი მოქმედების მექანიზმი, სავარაუდოდ, განსხვავდება მიკრომილაკების დეპოლიმერიზებელი აგენტების ტიპური მოქმედების მექანიზმებისგან. მაგალითად, მიკრომილაკების დეპოლიმერიზებელი აგენტების, როგორიცაა დიზოპირამიდი და ორიზალინი, უფრო მაღალი კონცენტრაციები იწვევს ეპიდერმული უჯრედების ანიზოტროპულ გაფართოებას, მაშინ როდესაც KAND 11 არ ახდენს ამას. გარდა ამისა, KAND 11-ისა და დიზოპირამიდის ერთობლივი გამოყენება იწვევს დიზოპირამიდით ინდუცირებული ფესვების ზრდის კომბინირებულ რეაქციას და დაფიქსირდა KAND 11-ით ინდუცირებული ზრდის ინჰიბირება (სურ. S4). ჩვენ ასევე გავაანალიზეთ ჰიპერმგრძნობიარე დიზოპირამიდ 1-1 (phs1-1) მუტანტის რეაქცია KAND 11-ზე. phs1-1-ს აქვს არაკანონიკური ტუბულინის კინაზას წერტილოვანი მუტაცია და დიზოპირამიდით დამუშავებისას უფრო მოკლე ფესვებს წარმოქმნის9,20. KAND 11 შემცველ აგარის გარემოზე გაზრდილ phs1-1 მუტანტის ნერგებს ჰქონდათ უფრო მოკლე ფესვები, დიზოპირამიდზე გაზრდილთა მსგავსი (სურ. S5).
გარდა ამისა, KAND 11-ით დამუშავებული ნერგების ფესვის მერისტემაში ჩვენ დავაკვირდით მიტოზურ მიკრომილაკების სტრუქტურებს, როგორიცაა პროფაზის ზონები, თითისტარა და ფრაგმოპლასტებს. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-ის დაკვირვებებთან შესაბამისობაში, დაფიქსირდა მიტოზური მიკრომილაკების რაოდენობის მნიშვნელოვანი შემცირება (სურ. 6გ).
KAND 11-ის ციტოტოქსიურობის დასახასიათებლად უჯრედშიდა გარჩევადობით, ჩვენ დავამუშავეთ თამბაქოს BY-2 სუსპენზიის უჯრედები KAND 11-ით და დავაკვირდით მათ რეაქციას. თავდაპირველად, KAND 11 დავამატეთ BY-2 უჯრედებს, რომლებიც გამოხატავენ TagRFP-TUA6-ს, რომელიც ფლუორესცენციულად ასახელებს მიკრომილაკებს, რათა შეგვეფასებინა KAND 11-ის გავლენა კორტიკალურ მიკრომილაკებზე. კორტიკალური მიკრომილაკების სიმკვრივე შეფასდა გამოსახულების ანალიზის გამოყენებით, რომელიც განსაზღვრავდა ციტოსკელეტური პიქსელების პროცენტულ მაჩვენებელს ციტოპლაზმურ პიქსელებს შორის. ანალიზის შედეგებმა აჩვენა, რომ 50 μM ან 100 μM KAND 11-ით 1 საათის განმავლობაში დამუშავების შემდეგ, სიმკვრივე მნიშვნელოვნად შემცირდა შესაბამისად 0.94 ± 0.74%-მდე ან 0.23 ± 0.28%-მდე, მაშინ როდესაც DMSO-თი დამუშავებული უჯრედების სიმკვრივე შეადგენდა 1.61 ± 0.34%-ს (სურ. 7ა). ეს შედეგები შეესაბამება Arabidopsis-ში დაკვირვებას, რომ KAND 11-ით დამუშავება იწვევს კორტიკალური მიკრომილაკების დეპოლიმერიზაციას (სურ. 6ბ). ჩვენ ასევე შევისწავლეთ BY-2 ხაზი GFP-ABD-ით მონიშნული აქტინის ძაფებით KAND 11-ის იგივე კონცენტრაციით დამუშავების შემდეგ და დავაკვირდით, რომ KAND 11-ით დამუშავებამ დაარღვია აქტინის ძაფები. 50 μM ან 100 μM KAND 11-ით 1 საათის განმავლობაში დამუშავებამ მნიშვნელოვნად შეამცირა აქტინის ძაფის სიმკვრივე შესაბამისად 1.20 ± 0.62%-მდე ან 0.61 ± 0.26%-მდე, მაშინ როდესაც DMSO-თი დამუშავებულ უჯრედებში სიმკვრივე იყო 1.69 ± 0.51% (სურ. 2). 7ბ). ეს შედეგები ეწინააღმდეგება პროპიზამიდის, რომელიც არ მოქმედებს აქტინის ძაფებზე, და ლატრუნკულინ B-ს, აქტინის დეპოლიმერიზატორის, რომელიც არ მოქმედებს მიკრომილაკებზე (SI სურათი S6). გარდა ამისა, კუმამონამიდით 1-ით, კუმამონაამიდის მჟავით 6-ით ან KAND 11-ით დამუშავებამ გავლენა არ მოახდინა მიკრომილაკებზე HeLa უჯრედებში (SI სურათი S7). ამგვარად, ითვლება, რომ KAND 11-ის მოქმედების მექანიზმი განსხვავდება ციტოჩონჩხის ცნობილი დესტრუქტორებისგან. გარდა ამისა, KAND 11-ით დამუშავებული BY-2 უჯრედების ჩვენმა მიკროსკოპულმა დაკვირვებამ გამოავლინა უჯრედების სიკვდილის დაწყება KAND 11-ით მკურნალობის დროს და აჩვენა, რომ ევანსის ლურჯად შეღებილი მკვდარი უჯრედების პროპორცია მნიშვნელოვნად არ გაიზარდა KAND 11-ით დამუშავების 30 წუთის შემდეგ, მაშინ როდესაც 50 μM ან 100 μM KAND-ით დამუშავების 90 წუთის შემდეგ, მკვდარი უჯრედების რაოდენობა გაიზარდა შესაბამისად 43.7%-მდე ან 80.1%-მდე (სურ. 7გ). ერთად აღებული, ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ ურსოლის მჟავას ახალი წარმოებული KAND 11 არის მცენარეული ციტოჩონჩხის ინჰიბიტორი, რომლის მოქმედების მექანიზმი აქამდე უცნობი იყო.
KAND გავლენას ახდენს კორტიკალურ მიკროტუბულებზე, აქტინის ფილამენტებზე და თამბაქოს BY-2 უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობაზე. (ა) კორტიკალური მიკროტუბულების ვიზუალიზაცია BY-2 უჯრედებში TagRFP-TUA6-ის თანაარსებობით. KAND 11-ით (50 μM ან 100 μM) ან DMSO-თი დამუშავებული BY-2 უჯრედები გამოკვლეული იქნა კონფოკალური მიკროსკოპიით. კორტიკალური მიკროტუბულების სიმკვრივე გამოითვალა 25 დამოუკიდებელი უჯრედის მიკროგრაფიებიდან. ასოები მნიშვნელოვან განსხვავებებს აღნიშნავს (Tukey HSD ტესტი, გვ.< 0.05). შკალის ზოლი = 10 µm. (ბ) BY-2 უჯრედებში კორტიკალური აქტინის ძაფები, რომლებიც ვიზუალიზებულია GFP-ABD2-ის თანაარსებობისას. KAND 11-ით (50 μM ან 100 μM) ან DMSO-თი დამუშავებული BY-2 უჯრედები გამოკვლეული იქნა კონფოკალური მიკროსკოპიით. კორტიკალური აქტინის ძაფების სიმკვრივე გამოითვალა 25 დამოუკიდებელი უჯრედის მიკროგრაფიებიდან. ასოები მნიშვნელოვან განსხვავებებს აღნიშნავს (Tukey HSD ტესტი, გვ.< 0.05). მასშტაბის ზოლი = 10 µm. (გ) მკვდარი BY-2 უჯრედების დაკვირვება ევანსის ლურჯი შეღებვით. KAND 11-ით (50 μM ან 100 μM) ან DMSO-თი დამუშავებული BY-2 უჯრედები გამოკვლეული იქნა კაშკაშა ველის მიკროსკოპიით. n=3. მასშტაბის ზოლი = 100 µm.
ახალი ბუნებრივი პროდუქტების აღმოჩენამ და გამოყენებამ მნიშვნელოვანი წინსვლა გამოიწვია ადამიანის ცხოვრების სხვადასხვა ასპექტში, მათ შორის მედიცინასა და სოფლის მეურნეობაში. ჩატარდა ისტორიული კვლევები ბუნებრივი რესურსებიდან სასარგებლო ნაერთების მისაღებად. კერძოდ, აქტინომიცეტები ცნობილია, როგორც ნემატოდების საწინააღმდეგო ანტიპარაზიტული ანტიბიოტიკები, მათი უნარის გამო, წარმოქმნან სხვადასხვა მეორადი მეტაბოლიტები, როგორიცაა ავერმექტინი, ივერმექტინისა და ბლეომიცინის წამყვანი ნაერთი და მისი წარმოებულები, რომლებიც გამოიყენება მედიცინაში, როგორც კიბოს საწინააღმდეგო საშუალება21,22. ანალოგიურად, აქტინომიცეტებიდან აღმოაჩინეს სხვადასხვა ჰერბიციდური ნაერთი, რომელთაგან ზოგიერთი უკვე გამოიყენება კომერციულად1,23. ამიტომ, აქტინომიცეტების მეტაბოლიტების ანალიზი სასურველი ბიოლოგიური აქტივობის მქონე ბუნებრივი პროდუქტების იზოლირებისთვის ეფექტურ სტრატეგიად ითვლება. ამ კვლევაში ჩვენ აღმოვაჩინეთ ახალი ნაერთი, კუმამონამიდი, S. werraensis-დან და წარმატებით სინთეზირდა იგი. ურსონის მჟავა არის ურბენამიდისა და მისი წარმოებულების სინთეზური შუალედური პროდუქტი. მას შეუძლია გამოიწვიოს ფესვების დამახასიათებელი დახვევა, გამოავლინოს ზომიერი ან ძლიერი ჰერბიციდური აქტივობა და პირდაპირ ან ირიბად დააზიანოს მცენარის მიკროტუბულები. თუმცა, ურმოტონური მჟავის მოქმედების მექანიზმი შეიძლება განსხვავდებოდეს არსებული მიკროტუბულების ინჰიბიტორებისგან, რადგან KAND 11 ასევე არღვევს აქტინის ძაფებს და იწვევს უჯრედების სიკვდილს, რაც მიუთითებს მარეგულირებელ მექანიზმზე, რომლითაც ურმოტონური მჟავა და მისი წარმოებულები გავლენას ახდენენ ციტოჩონჩხის სტრუქტურების ფართო სპექტრზე.
ურბენონის მჟავის შემდგომი დეტალური დახასიათება ხელს შეუწყობს ურბენონის მჟავის მოქმედების მექანიზმის უკეთ გაგებას. კერძოდ, შემდეგი მიზანია ურბენონის მჟავის შეკავშირების უნარის შეფასება აღდგენილ მიკრომილაკებთან, რათა დადგინდეს, მოქმედებენ თუ არა ურბენონის მჟავა და მისი წარმოებულები პირდაპირ მიკრომილაკებზე და დეპოლიმერიზებენ თუ არა მათ, თუ მათი მოქმედება იწვევს მიკრომილაკების დესტაბილიზაციას. გარდა ამისა, იმ შემთხვევაში, თუ მიკრომილაკები არ წარმოადგენს პირდაპირ სამიზნეს, მცენარეულ უჯრედებზე ურბენონის მჟავის მოქმედების ადგილისა და მოლეკულური სამიზნეების იდენტიფიცირება ხელს შეუწყობს დაკავშირებული ნაერთების თვისებების და ჰერბიციდური აქტივობის გაუმჯობესების შესაძლო გზების უკეთ გაგებას. ჩვენმა ბიოაქტიურობის ანალიზმა გამოავლინა ურბენონის მჟავის უნიკალური ციტოტოქსიური უნარი ისეთი მცენარეების ზრდაზე, როგორიცაა Arabidopsis thaliana, თამბაქო და ღვიძლის სპირტი, მაშინ როდესაც არც E. coli და არც HeLa უჯრედები არ დაზარალდნენ. ცხოველური უჯრედებისთვის მცირე ან საერთოდ არარსებობა ურბენონის მჟავის წარმოებულების უპირატესობაა, თუ ისინი შემუშავდება როგორც ჰერბიციდები ღია სასოფლო-სამეურნეო მინდვრებში გამოსაყენებლად. მართლაც, რადგან მიკრომილაკები ეუკარიოტებში გავრცელებული სტრუქტურებია, მცენარეებში მათი შერჩევითი ინჰიბირება ჰერბიციდების მთავარი მოთხოვნაა. მაგალითად, პროპიზამიდი, მიკრომილაკების დეპოლიმერიზატორი, რომელიც პირდაპირ უკავშირდება ტუბულინს და აფერხებს პოლიმერიზაციას, გამოიყენება ჰერბიციდის სახით ცხოველური უჯრედების მიმართ მისი დაბალი ტოქსიკურობის გამო24. დიზოპირამიდისგან განსხვავებით, მონათესავე ბენზამიდებს განსხვავებული სამიზნე სპეციფიკურობა აქვთ. მცენარეთა მიკრომილაკების გარდა, RH-4032 ან ბენზოქსამიდი ასევე აფერხებს ცხოველური უჯრედების ან ოომიცეტების მიკრომილაკებს, შესაბამისად, ხოლო ზალილამიდი გამოიყენება ფუნგიციდის სახით მისი დაბალი ფიტოტოქსიკურობის გამო25,26,27. ახლად აღმოჩენილი დათვი და მისი წარმოებულები ავლენენ შერჩევით ციტოტოქსიურობას მცენარეების მიმართ, მაგრამ აღსანიშნავია, რომ შემდგომმა მოდიფიკაციებმა შეიძლება შეცვალოს მათი სამიზნე სპეციფიკურობა, რაც პოტენციურად უზრუნველყოფს დამატებით წარმოებულებს პათოგენური სოკოების ან ოომიცეტების კონტროლისთვის.
ურბენონის მჟავისა და მისი წარმოებულების უნიკალური თვისებები სასარგებლოა მათი ჰერბიციდების სახით განვითარებისა და კვლევის ინსტრუმენტების სახით გამოყენებისთვის. ციტოჩონჩხის მნიშვნელობა მცენარეთა უჯრედების ფორმის კონტროლში ფართოდ არის აღიარებული. ადრე ჩატარებულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ მცენარეებმა განავითარეს კორტიკალური მიკრომილაკების ორგანიზაციის რთული მექანიზმები მიკრომილაკების დინამიკის კონტროლით მორფოგენეზის სათანადოდ გასაკონტროლებლად. იდენტიფიცირებულია მიკრომილაკების აქტივობის რეგულირებისთვის პასუხისმგებელი მოლეკულების დიდი რაოდენობა და მასთან დაკავშირებული კვლევები კვლავ მიმდინარეობს3,4,28. მცენარეთა უჯრედებში მიკრომილაკების დინამიკის შესახებ ჩვენი ამჟამინდელი გაგება სრულად არ ხსნის კორტიკალური მიკრომილაკების ორგანიზაციის მექანიზმებს. მაგალითად, მიუხედავად იმისა, რომ როგორც დიზოპირამიდს, ასევე ორიზალინს შეუძლიათ მიკრომილაკების დეპოლიმერიზაცია, დიზოპირამიდი იწვევს ფესვების ძლიერ დამახინჯებას, ხოლო ორიზალინს აქვს შედარებით მსუბუქი ეფექტი. გარდა ამისა, ტუბულინის მუტაციები, რომელიც ასტაბილურებს მიკრომილაკებს, ასევე იწვევს დექსტროროტაციას ფესვებში, მაშინ როდესაც პაკლიტაქსელი, რომელიც ასევე ასტაბილურებს მიკრომილაკების დინამიკას, არ იწვევს ამას. ამიტომ, ურსოლის მჟავის მოლეკულური სამიზნეების შესწავლამ და იდენტიფიცირებამ უნდა მოგვცეს ახალი წარმოდგენა მცენარის კორტიკალური მიკრომილაკების რეგულირების შესახებ. ანალოგიურად, ისეთი ქიმიკატების მომავალი შედარება, რომლებიც ეფექტურია ზრდის დამახინჯების ხელშეწყობაში, როგორიცაა დიზოპირამიდი, და ნაკლებად ეფექტური ქიმიკატების, როგორიცაა ორიზალინი ან კუმამოტორული მჟავა, მიგვანიშნებს იმაზე, თუ როგორ ხდება ზრდის დამახინჯება.
მეორე მხრივ, დაცვასთან დაკავშირებული ციტოჩონჩხის გადალაგება ურსონის მჟავას ციტოტოქსიკურობის ახსნის კიდევ ერთი შესაძლებლობაა. პათოგენის ინფიცირება ან მცენარეულ უჯრედებში ელიციტორის შეყვანა ზოგჯერ იწვევს ციტოჩონჩხის განადგურებას და შემდგომ უჯრედების სიკვდილს29. მაგალითად, ოომიცეტისგან მიღებული კრიპტოქსანტინი, როგორც აღინიშნა, არღვევს მიკრომილაკებსა და აქტინის ფილამენტებს თამბაქოს უჯრედების სიკვდილამდე, მსგავსად იმისა, რაც ხდება KAND მკურნალობის დროს30,31. ურსონის მჟავით გამოწვეულ დამცავ რეაქციებსა და უჯრედულ რეაქციებს შორის მსგავსებამ მიგვიყვანა ჰიპოთეზის გამოთქმამდე, რომ ისინი იწვევენ საერთო უჯრედულ პროცესებს, თუმცა აშკარაა ურსონის მჟავას უფრო სწრაფი და ძლიერი ეფექტი, ვიდრე კრიპტოქსანტინის. თუმცა, კვლევებმა აჩვენა, რომ აქტინის ფილამენტების დარღვევა ხელს უწყობს სპონტანურ უჯრედულ სიკვდილს, რასაც ყოველთვის არ ახლავს მიკრომილაკების დარღვევა29. გარდა ამისა, ჯერ კიდევ გასარკვევია, იწვევს თუ არა პათოგენი ან ელიციტორი ფესვების დამახინჯებულ ზრდას, როგორც ამას ურსონის მჟავას წარმოებულები აკეთებენ. ამრიგად, დამცავ რეაქციებსა და ციტოჩონჩხს შორის დამაკავშირებელი მოლეკულური ცოდნა მიმზიდველი პრობლემაა, რომლის მოგვარებაც აუცილებელია. ურსონის მჟავასთან დაკავშირებული დაბალი მოლეკულური წონის ნაერთების, ასევე სხვადასხვა პოტენციის მქონე წარმოებულების სპექტრის გამოყენების გზით, მათ შეიძლება შექმნან შესაძლებლობები უცნობი უჯრედული მექანიზმების დამიზნებისთვის.
ერთად აღებული, მიკრომილაკების დინამიკის მოდულირების ახალი ნაერთების აღმოჩენა და გამოყენება უზრუნველყოფს ძლიერ მეთოდებს მცენარის უჯრედის ფორმის განსაზღვრის საფუძვლად მყოფი რთული მოლეკულური მექანიზმების გადასაჭრელად. ამ კონტექსტში, ახლახან შემუშავებული ნაერთი ურმოტონური მჟავა, რომელიც გავლენას ახდენს მიკრომილაკებსა და აქტინის ფილამენტებზე და იწვევს უჯრედების სიკვდილს, შესაძლოა შესაძლებლობას იძლეოდეს გავიგოთ კავშირი მიკრომილაკების კონტროლსა და ამ სხვა მექანიზმებს შორის. ამრიგად, ურბენონის მჟავის გამოყენებით ქიმიური და ბიოლოგიური ანალიზი დაგვეხმარება გავიგოთ მოლეკულური მარეგულირებელი მექანიზმები, რომლებიც აკონტროლებენ მცენარის ციტოჩონჩხს.
S. werraensis MK493-CF1 ჩაასხით 500 მლ-იან დეფლექტორიან ერლენმაიერის კოლბაში, რომელიც შეიცავს 110 მლ სათესლე გარემოს, რომელიც შედგება 2% (w/v) გალაქტოზისგან, 2% (w/v) ესენციის პასტისგან, 1% (w/v) Bacto შემადგენლობისგან. სოიონი (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) სიმინდის ექსტრაქტისგან (KOGOSTCH Co., Ltd., იაპონია), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 და 0.2% CaCO3 დეიონიზებულ წყალში. (pH 7.4 სტერილიზაციამდე). სათესლე კულტურები ინკუბირებული იქნა როტაციულ შეიკერზე (180 ბრ/წთ) 27°C ტემპერატურაზე 2 დღის განმავლობაში. წარმოების კულტივაცია მყარი მდგომარეობის დუღილის გზით. თესლის კულტურა (7 მლ) გადაიტანეს 500 მლ K-1 კოლბაში, რომელიც შეიცავდა 40 გ საწარმოო გარემოს, რომელიც შედგებოდა 15 გ დაპრესილი ქერისგან (MUSO Co., Ltd., იაპონია) და 25 გ დეიონიზებული წყლისგან (pH სტერილიზაციამდე არ იყო რეგულირებული). დუღილი ჩატარდა 30°C ტემპერატურაზე, სიბნელეში 14 დღის განმავლობაში. დუღილის მასალა ექსტრაგირებული იქნა 40 მლ/ბოთლში EtOH-ით და დაცენტრიფუგირებული იქნა (1500 გ, 4°C, 10 წთ). კულტურის ზედა ფენა (60 მლ) ექსტრაგირებული იქნა 10% MeOH/EtOAc ნარევით. ორგანული ფენა აორთქლდა შემცირებული წნევის ქვეშ ნარჩენის (59.5 მგ) მისაღებად, რომელიც დაექვემდებარა HPLC-ს გრადიენტული ელუციით (0–10 წუთი: 90%) უკუფაზურ სვეტზე (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 მმ × სიგრძე 250 მმ) H2O/CH3CN, 10–35 წუთი: 90% H2O/CH3CN-დან 70% H2O/CH3CN-მდე (გრადიენტი), 35–45 წუთი: 90% H2O/EtOH, 45–155 წუთი: 90% H2O/EtOH-დან 100% EtOH-მდე (გრადიენტი (გრადიენტი), 155–200 წთ: 100% EtOH) 1.5 მლ/წთ ნაკადის სიჩქარით, კუმამონამიდი (1, 36.0 მგ) გამოიყო თეთრი ამორფული ფხვნილის სახით.
კუმამოტოამიდი(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ გამოთვლილი მნიშვნელობა: 141.0659, გაზომილი მნიშვნელობა: 141.0663, IR βmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 სმ–1.
კოლუმბიის თესლი (Col-0) მიღებული იქნა Arabidopsis-ის ბიოლოგიური რესურსების ცენტრიდან (ABRC) კვლევის ნებართვით. Col-0 თესლი გამრავლდა და შენარჩუნდა ჩვენი ლაბორატორიული პირობებით და გამოყენებული იქნა როგორც ველური ტიპის Arabidopsis-ის მცენარეები. Arabidopsis-ის თესლი ზედაპირულად სტერილიზებული და კულტივირებული იქნა ნახევრად სიძლიერის Murashige-სა და Skoog-ის გარემოში, რომელიც შეიცავდა 2% საქაროზას (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-მორფოლინო)ეთანსულფონის მჟავას (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) და 1.5% აგარს (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, 23°C ტემპერატურაზე და მუდმივ განათებაზე. phs1-1 მუტანტის თესლი მოწოდებული იყო ტ. ჰაშიმოტოს (ნარას მეცნიერებისა და ტექნოლოგიების ინსტიტუტი) მიერ.
SR-1 შტამის თესლი მოწოდებული იქნა ტ. ჰაშიმოტოს (ნარას მეცნიერებისა და ტექნოლოგიების ინსტიტუტი) მიერ და გამოყენებული იქნა როგორც ველური ტიპის თამბაქოს მცენარეები. თამბაქოს თესლი ზედაპირულად სტერილიზებული იქნა და სამი ღამის განმავლობაში სტერილურ წყალში დალბული იქნა აღმოცენების ხელშესაწყობად, შემდეგ მოათავსეს ნახევრად კონცენტრირებულ ხსნარში, რომელიც შეიცავდა 2% საქაროზას, 0.05% (w/v) MES-ს და 0.8% გელანის რეზინას (Fujifilm Wako Pure Chemical) (მურაშიგე და სკოოგის გარემო) pH 5.7-ით და ინკუბირებული იქნა 23°C ტემპერატურაზე მუდმივი განათების ქვეშ.
შტამი Tak-1 მოწოდებული იქნა ტ. კოჩის (კიოტოს უნივერსიტეტი) მიერ და გამოყენებული იქნა ღვიძლის ტუბერკულოზის კვლევის სტანდარტულ ექსპერიმენტულ ერთეულად. გემა მიღებული იქნა სტერილიზებული კულტივირებული მცენარეებისგან და შემდეგ დარგეს Gamborg B5 გარემოზე (Fujifilm Wako Pure Chemical), რომელიც შეიცავდა 1% საქაროზას და 0.3% გელანის ფისს და ინკუბირებული იქნა 23°C ტემპერატურაზე უწყვეტი განათების ქვეშ.
თამბაქოს BY-2 უჯრედები (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) მოწოდებულია ს. ჰასეზავას (ტოკიოს უნივერსიტეტი) მიერ. BY-2 უჯრედები განზავდა 95-ჯერ მოდიფიცირებულ ლინსმაიერისა და სკუგის გარემოში და ყოველკვირეულად დაემატა 2,4-დიქლორფენოქსიძმარმჟავა 32. უჯრედული სუსპენზია შერეული იყო როტაციულ შეიკერზე 130 ბრ/წთ სიჩქარით 27°C ტემპერატურაზე, სიბნელეში. გარეცხეთ უჯრედები ახალი გარემოს 10-ჯერ მეტი მოცულობით და ხელახლა შეანჯღრიეთ იმავე გარემოში. BY-2 ტრანსგენური უჯრედული ხაზები, რომლებიც სტაბილურად გამოხატავენ მიკროტუბულების მარკერს TagRFP-TUA6 ან აქტინის ძაფის მარკერს GFP-ABD2 ყვავილოვანი კომბოსტოს მოზაიკური ვირუსის 35S პრომოუტერის ქვეშ, გენერირებული იქნა აღწერილი მეთოდით33,34,35. ამ უჯრედული ხაზების შენარჩუნება და სინქრონიზაცია შესაძლებელია ორიგინალური BY-2 უჯრედული ხაზისთვის გამოყენებული პროცედურების მსგავსი პროცედურების გამოყენებით.
HeLa უჯრედები კულტივირებული იქნა Dulbecco-ს მოდიფიცირებულ Eagle-ის გარემოში (DMEM) (Life Technologies), რომელშიც შედიოდა 10% ნაყოფის ძროხის შრატი, 1.2 U/მლ პენიცილინი და 1.2 μg/მლ სტრეპტომიცინი 37°C ინკუბატორში 5% CO2-ით.
ამ ხელნაწერში აღწერილი ყველა ექსპერიმენტი ჩატარდა იაპონიის ბიოუსაფრთხოების რეგულაციებისა და სახელმძღვანელო პრინციპების შესაბამისად.
ნაერთები გახსნილი იქნა დიმეთილსულფოქსიდში (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) საწყის ხსნარებში და განზავებული იქნა MS გარემოში Arabidopsis-ისა და თამბაქოსთვის ან Gamborg B5 გარემოში ღვიძლის ჭაობისთვის. ფესვის ზრდის ინჰიბირების ანალიზისთვის, თითო ფირფიტაზე 10-ზე მეტი თესლი დაითესა აგარის გარემოში, რომელიც შეიცავდა მითითებულ ნაერთებს ან DMSO-ს. თესლი ინკუბირებული იქნა ზრდის კამერაში 7 დღის განმავლობაში. ნერგები გადაიღეს და გაიზომა ფესვების სიგრძე. Arabidopsis-ის აღმოცენების ანალიზისთვის, თითო ფირფიტაზე 48 თესლი დაითესა აგარის გარემოში, რომელიც შეიცავდა 200 μM ნაერთს ან DMSO-ს. Arabidopsis-ის თესლი გაიზარდა ზრდის კამერაში და აღმოცენებული ნერგების რაოდენობა დაითვალა აღმოცენებიდან 7 დღის შემდეგ (dag). თამბაქოს აღმოცენების ანალიზისთვის, თითო ფირფიტაზე 24 თესლი დაითესა აგარის გარემოში, რომელიც შეიცავდა 200 μM KAND ან DMSO-ს. თამბაქოს თესლი გაიზარდა ზრდის კამერაში და აღმოცენებული ნერგების რაოდენობა დაითვალა 14 დღის შემდეგ. ღვიძლის ზრდის ინჰიბირების ანალიზისთვის, თითოეული ფირფიტიდან 9 ემბრიონი მოათავსეს აგარ-მედიამენტურ გარემოში, რომელიც შეიცავდა KAND-ის ან DMSO-ს მითითებულ კონცენტრაციებს და 14 დღის განმავლობაში ინკუბირებული იქნა ზრდის კამერაში.
ფესვის მერისტემის ორგანიზაციის ვიზუალიზაციისთვის გამოიყენეთ 5 მგ/მლ პროპიდიუმის იოდიდით (PI) შეღებილი ნერგები. PI სიგნალები დაკვირვებული იქნა ფლუორესცენტული მიკროსკოპით TCS SPE კონფოკალური ლაზერული სკანირების მიკროსკოპის (Leica Microsystems) გამოყენებით.
ფესვების ჰისტოქიმიური შეღებვა β-გლუკურონიდაზათი (GUS) ჩატარდა მალამის და ბენფეის36 მიერ აღწერილი პროტოკოლის მიხედვით. ნერგები დააფიქსირეს 90%-იან აცეტონში მთელი ღამით, შეღებეს 0.5 მგ/მლ 5-ბრომ-4-ქლორ-3-ინდოლილ-β-d-გლუკურონის მჟავით GUS ბუფერში 1 საათის განმავლობაში და მოათავსეს ჰიდრატირებულ ქლორალდეჰიდის ხსნარში (8 გ ქლორალის ჰიდრატი, 2 მლ წყალი და 1 მლ გლიცეროლი) და დააკვირდნენ დიფერენციალური ინტერფერენციული კონტრასტული მიკროსკოპიით Axio Imager M1 მიკროსკოპის (Carl Zeiss) გამოყენებით.
ვერტიკალურად განლაგებულ თეფშებზე გაზრდილ 7 დღის ნერგებზე გაიზომა ფესვების კუთხეები. გაზომეთ ფესვის კუთხე გრავიტაციის ვექტორის მიმართულებიდან, როგორც ეს აღწერილია მე-6 ნაბიჯში.
კორტიკალური მიკროტუბულების განლაგება დაფიქსირდა აღწერილი მეთოდით, პროტოკოლში 37 მცირედი ცვლილებებით. β-ტუბულინის საწინააღმდეგო ანტისხეული (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) და Alexa Fluor 488-თან კონიუგირებული თაგვის საწინააღმდეგო IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) გამოყენებული იქნა პირველადი და მეორადი ანტისხეულების სახით, შესაბამისად, 1:1000 და 1:100 განზავებით. ფლუორესცენციული გამოსახულებები მიღებული იქნა TCS SPE კონფოკალური ლაზერული სკანირების მიკროსკოპის (Leica Microsystems) გამოყენებით. Z-stack გამოსახულებები მიღებული იქნა და მაქსიმალური ინტენსივობის პროექციები შეიქმნა მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად.
HeLa უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზი ჩატარდა უჯრედების დათვლის ნაკრები 8-ის (Dojindo) გამოყენებით, მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად.
E. coli DH5α-ს ზრდა გაანალიზდა უჯრედის სიმკვრივის გაზომვით კულტურაში სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით 600 ნმ-ზე (OD600).
ტრანსგენურ BY-2 უჯრედებში ციტოჩონჩხის ორგანიზაცია დაფიქსირდა ფლუორესცენტული მიკროსკოპის გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო CSU-X1 კონფოკალური სკანირების მოწყობილობით (Yokogawa) და sCMOS კამერით (Zyla, Andor Technology). ციტოჩონჩხის სიმკვრივე შეფასდა გამოსახულების ანალიზით, რომელიც განსაზღვრავდა ციტოსკელეტური პიქსელების პროცენტულ მაჩვენებელს კონფოკალურ სურათებში ImageJ პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით, როგორც ეს აღწერილია38,39.
BY-2 უჯრედებში უჯრედების სიკვდილის დასადგენად, უჯრედული სუსპენზიის ალიკვოტი ინკუბირებული იქნა 0.05%-იანი ევანსის ლურჯი ხსნარით 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. მკვდარი უჯრედების სელექციური ევანსის ლურჯი შეღებვა დამოკიდებულია სიცოცხლისუნარიანი უჯრედებიდან საღებავის ექსტრუზიაზე ხელუხლებელი პლაზმური მემბრანის მიერ40. შეღებილი უჯრედები დაკვირვებული იქნა კაშკაშა ველის მიკროსკოპის გამოყენებით (BX53, Olympus).
HeLa უჯრედები გაიზარდა DMEM-ში, რომელიც შეიცავდა 10%-იან FBS-ს დატენიანებულ ინკუბატორში 37°C ტემპერატურაზე და 5% CO2-ზე. უჯრედები დამუშავდა 100 μM KAND 11-ით, კუმამონამის მჟავა 6-ით, კუმამონამიდით 1-ით, 100 ნგ/მლ კოლცემიდით (Gibco) ან 100 ნგ/მლ ნოკოდმაზით (Sigma) 6 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. უჯრედები დააფიქსირეს MetOH-ით 10 წუთის განმავლობაში და შემდეგ აცეტატით 5 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. დაფიქსირებული უჯრედები ინკუბირებული იქნა β-ტუბულინის პირველადი ანტისხეულით (1D4A4, Proteintech: 66240-1), რომელიც განზავდა 0.5% BSA/PBS-ში 2 საათის განმავლობაში, 3-ჯერ გაირეცხა TBST-ით და შემდეგ ინკუბირებული იქნა Alexa Fluor თხის ანტისხეულით. 488 1 საათის განმავლობაში. – თაგვის IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) და 15 ნგ/მლ 4′,6-დიამიდინო-2-ფენილინდოლი (DAPI), განზავებული 0.5% BSA/PBS-ში. TBST-ით სამჯერ გარეცხვის შემდეგ, შეღებილი უჯრედები დაკვირვებული იქნა Nikon Eclipse Ti-E ინვერტირებულ მიკროსკოპზე. სურათები გადაღებულია გაცივებული Hamamatsu ORCA-R2 CCD კამერით MetaMorph პროგრამული უზრუნველყოფის (Molecular Devices) გამოყენებით.