იოდის და ავერმექტინის, როგორც ფიჭვის ნემატოდური დაავადების ინდუქტორების, შეფასება

ფიჭვის ნემატოდი არის საკარანტინო მიგრირებადი ენდოპარაზიტი, რომელიც ცნობილია ფიჭვის ტყის ეკოსისტემებში სერიოზული ეკონომიკური დანაკარგების გამოწვევით. ამ კვლევაში განხილულია ჰალოგენიზებული ინდოლების ნემატიციდური აქტივობა ფიჭვის ნემატოდების წინააღმდეგ და მათი მოქმედების მექანიზმი. 5-იოდოინდოლისა და ავერმექტინის (დადებითი კონტროლი) ნემატიციდური აქტივობა ფიჭვის ნემატოდების წინააღმდეგ მსგავსი და მაღალი იყო დაბალ კონცენტრაციებზე (10 მკგ/მლ). 5-იოდოინდოლმა შეამცირა ნაყოფიერება, რეპროდუქციული აქტივობა, ემბრიონული და ლარვების სიკვდილიანობა და მოძრაობითი ქცევა. ლიგანდების მოლეკულური ურთიერთქმედება უხერხემლოების სპეციფიკურ გლუტამატ-დამოკიდებულ ქლორიდის არხის რეცეპტორებთან ადასტურებს იმ აზრს, რომ 5-იოდოინდოლი, ავერმექტინის მსგავსად, მჭიდროდ უკავშირდება რეცეპტორის აქტიურ ცენტრს. 5-იოდოინდოლმა ასევე გამოიწვია სხვადასხვა ფენოტიპური დეფორმაციები ნემატოდებში, მათ შორის ორგანოების პათოლოგიური კოლაფსი/შეკუმშვა და ვაკუოლიზაციის გაზრდა. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ვაკუოლებმა შეიძლება როლი ითამაშონ ნემატოდების მეთილირებით განპირობებულ სიკვდილში. მნიშვნელოვანია, რომ 5-იოდოინდოლი არატოქსიკური იყო ორივე მცენარის სახეობისთვის (კომბოსტო და ბოლოკი). ამრიგად, ეს კვლევა აჩვენებს, რომ იოდოინდოლის გამოყენებას გარემო პირობებში შეუძლია ფიჭვის ჭკნობის დაზიანების კონტროლი.
ფიჭვის ნემატოდი (Bursaphelenchus xylophilus) მიეკუთვნება ფიჭვის ნემატოდებს (PWN), მიგრირებად ენდოპარაზიტულ ნემატოდებს, რომლებიც ცნობილია ფიჭვის ტყის ეკოსისტემების მძიმე ეკოლოგიური ზიანის მიყენებით1. ფიჭვის ნემატოდით გამოწვეული ფიჭვის ჭკნობის დაავადება (PWD) სერიოზულ პრობლემად იქცევა რამდენიმე კონტინენტზე, მათ შორის აზიასა და ევროპაში, ხოლო ჩრდილოეთ ამერიკაში ნემატოდი ანადგურებს ინტროდუცირებულ ფიჭვის სახეობებს1,2. ფიჭვის ხეების გამრავლება მნიშვნელოვანი ეკონომიკური პრობლემაა და მისი გლობალური გავრცელების პერსპექტივა შემაშფოთებელია3. ნემატოდი ყველაზე ხშირად ესხმის თავს ფიჭვის შემდეგ სახეობებს: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii და Pinus radiata4. ფიჭვის ნემატოდი სერიოზული დაავადებაა, რომელსაც შეუძლია ფიჭვის ხეების მოკვლა ინფიცირებიდან კვირების ან თვეების განმავლობაში. გარდა ამისა, ფიჭვის ნემატოდების აფეთქებები ხშირია სხვადასხვა ეკოსისტემაში, ამიტომ ჩამოყალიბდა მუდმივი ინფექციის ჯაჭვები1.
Bursaphelenchus xylophilus არის საკარანტინო მცენარე-პარაზიტული ნემატოდი, რომელიც მიეკუთვნება Aphelenchoidea-ს ზეოჯახს და 102.5 კლადს. ნემატოდი იკვებება სოკოებით და მრავლდება ფიჭვის ხის ქსოვილებში, ვითარდება ოთხ სხვადასხვა ლარვის სტადიაში: L1, L2, L3, L4 და ზრდასრული ინდივიდი1,6. საკვების დეფიციტის პირობებში, ფიჭვის ნემატოდი გადადის სპეციალიზებულ ლარვის სტადიაში - დაუერში, რომელიც პარაზიტობს მის გადამტანზე - ფიჭვის ქერქის ხოჭოზე (Monochamus alternatus) და გადადის ჯანმრთელ ფიჭვებზე. ჯანმრთელ მასპინძლებში ნემატოდები სწრაფად მიგრირებენ მცენარის ქსოვილებში და იკვებებიან პარენქიმატოზური უჯრედებით, რაც იწვევს ჰიპერმგრძნობელობის რეაქციების რიგს, ფიჭვის ჭკნობას და სიკვდილს ინფიცირებიდან ერთი წლის განმავლობაში1,7,8.
ფიჭვის ნემატოდების ბიოლოგიური კონტროლი დიდი ხანია გამოწვევას წარმოადგენს, საკარანტინო ზომები კი მე-20 საუკუნიდან იღებს სათავეს. ფიჭვის ნემატოდების კონტროლის ამჟამინდელი სტრატეგიები ძირითადად ქიმიურ დამუშავებას მოიცავს, მათ შორის ხის ფუმიგაციას და ნემატიციდების ხის ტოტებში ჩანერგვას. ყველაზე ხშირად გამოყენებული ნემატიციდებია ავერმექტინი და ავერმექტინის ბენზოატი, რომლებიც ავერმექტინის ოჯახს მიეკუთვნება. ეს ძვირადღირებული ქიმიკატები ძალიან ეფექტურია ნემატოდების მრავალი სახეობის წინააღმდეგ და გარემოსდაცვით უსაფრთხოდ ითვლება9. თუმცა, ამ ნემატიციდების განმეორებითი გამოყენება, სავარაუდოდ, შექმნის სელექციურ ზეწოლას, რაც თითქმის დანამდვილებით გამოიწვევს რეზისტენტული ფიჭვის ნემატოდების გაჩენას, როგორც ეს დადასტურდა რამდენიმე მწერი მავნებლის შემთხვევაში, როგორიცაა Leptinotarsa ​​​​decemlineata, Plutella xylostella და ნემატოდები Trichostrongylus colubriformis და Ostertagia circumcincta, რომლებმაც თანდათანობით განივითარეს რეზისტენტობა ავერმექტინების მიმართ10,11,12. ამიტომ, რეზისტენტობის ნიმუშების რეგულარული შესწავლა და ნემატიციდების მუდმივი შემოწმებაა საჭირო, რათა მოიძებნოს ალტერნატიული, ეკონომიური და გარემოსთვის უსაფრთხო ზომები PVD-ის კონტროლისთვის. ბოლო ათწლეულების განმავლობაში, არაერთმა ავტორმა შემოგვთავაზა მცენარეული ექსტრაქტების, ეთერზეთებისა და აქროლადი ნივთიერებების გამოყენება ნემატოდების კონტროლის აგენტებად13,14,15,16.
ცოტა ხნის წინ ჩვენ Caenorhabditis elegans-ში ვაჩვენეთ ინდოლის, უჯრედშორისი და სამეფოთაშორისი სასიგნალო მოლეკულის, ნემატიციდური აქტივობა 17. ინდოლი მიკრობულ ეკოლოგიაში ფართოდ გავრცელებული უჯრედშიდა სიგნალია, რომელიც აკონტროლებს მრავალ ფუნქციას, რომლებიც გავლენას ახდენენ მიკრობულ ფიზიოლოგიაზე, სპორების წარმოქმნაზე, პლაზმიდების სტაბილურობაზე, წამლის მიმართ რეზისტენტობაზე, ბიოაპკის წარმოქმნასა და ვირულენტობაზე 18, 19. ინდოლისა და მისი წარმოებულების აქტივობა სხვა პათოგენური ნემატოდების წინააღმდეგ არ არის შესწავლილი. ამ კვლევაში ჩვენ გამოვიკვლიეთ 34 ინდოლის ნემატოციდური აქტივობა ფიჭვის ნემატოდების წინააღმდეგ და განვმარტეთ ყველაზე ძლიერი 5-იოდოინდოლის მოქმედების მექანიზმი მიკროსკოპიის, დროის შენელებული ფოტოგრაფიისა და მოლეკულური დოკინგის ექსპერიმენტების გამოყენებით და შევაფასეთ მისი ტოქსიკური ეფექტები მცენარეებზე თესლის გაღივების ანალიზის გამოყენებით.
ადრე აღინიშნა ინდოლის მაღალი კონცენტრაციები (>1.0 mM) ნემატოდებზე ნემატოციდურ ეფექტს17. B. xylophilus-ის (შერეული სასიცოცხლო სტადიები) ინდოლით ან 33 სხვადასხვა ინდოლის წარმოებულით 1 mM დოზით დამუშავების შემდეგ, B. xylophilus-ის სიკვდილიანობა გაიზომა ცოცხალი და მკვდარი ნემატოდების დათვლით საკონტროლო და დამუშავებულ ჯგუფებში. ხუთმა ინდოლმა აჩვენა მნიშვნელოვანი ნემატოციდური აქტივობა; დაუმუშავებელი საკონტროლო ჯგუფის გადარჩენა 24 საათის შემდეგ 95 ± 7% იყო. გამოცდილი 34 ინდოლიდან, 5-იოდოინდოლმა და 4-ფტორინდოლმა 1 mM დოზით გამოიწვია 100%-იანი სიკვდილიანობა, ხოლო 5,6-დიფტორინდიგომ, მეთილინდოლ-7-კარბოქსილატმა და 7-იოდოინდოლმა გამოიწვია დაახლოებით 50%-იანი სიკვდილიანობა (ცხრილი 1).
5-იოდოინდოლის გავლენა ფიჭვის ნემატოდის ვაკუოლების ფორმირებასა და მეტაბოლიზმზე. (A) ავერმექტინისა და 5-იოდოინდოლის გავლენა ზრდასრულ მამრ ნემატოდებზე, (B) L1 სტადიის ნემატოდის კვერცხები და (C) B. xylophilus-ის მეტაბოლიზმი, (i) ვაკუოლები 0 საათის შემდეგ არ დაფიქსირებულა, დამუშავების შედეგად წარმოიქმნა (ii) ვაკუოლები, (iii) მრავალი ვაკუოლის დაგროვება, (iv) ვაკუოლების შეშუპება, (v) ვაკუოლების შერწყმა და (vi) გიგანტური ვაკუოლების წარმოქმნა. წითელი ისრები მიუთითებს ვაკუოლების შეშუპებაზე, ლურჯი ისრები მიუთითებს ვაკუოლების შერწყმაზე, ხოლო შავი ისრები გიგანტურ ვაკუოლებზე. შკალის ზოლი = 50 μm.
გარდა ამისა, ამ კვლევაში ასევე აღწერილია ფიჭვის ნემატოდებში მეთანით გამოწვეული სიკვდილის თანმიმდევრული პროცესი (სურათი 4C). მეთანოგენური სიკვდილი არის უჯრედული სიკვდილის არააპოპტოზური ტიპი, რომელიც დაკავშირებულია თვალსაჩინო ციტოპლაზმური ვაკუოლების დაგროვებასთან27. ფიჭვის ნემატოდებში დაფიქსირებული მორფოლოგიური დეფექტები, როგორც ჩანს, მჭიდრო კავშირშია მეთანით გამოწვეული სიკვდილის მექანიზმთან. სხვადასხვა დროს მიკროსკოპულმა გამოკვლევამ აჩვენა, რომ გიგანტური ვაკუოლები წარმოიქმნა 5-იოდოინდოლის (0.1 mM) 20 საათის შემდეგ. მიკროსკოპული ვაკუოლები დაფიქსირდა დამუშავებიდან 8 საათის შემდეგ და მათი რაოდენობა გაიზარდა 12 საათის შემდეგ. რამდენიმე დიდი ვაკუოლი დაფიქსირდა 14 საათის შემდეგ. რამდენიმე შერწყმული ვაკუოლი აშკარად ჩანდა დამუშავებიდან 12-16 საათის შემდეგ, რაც მიუთითებს, რომ ვაკუოლების შერწყმა მეთანოგენური სიკვდილის მექანიზმის საფუძველია. 20 საათის შემდეგ, ჭიაყელაში რამდენიმე გიგანტური ვაკუოლი აღმოაჩინეს. ეს დაკვირვებები წარმოადგენს C. elegans-ში მეტუოზის პირველ შემთხვევას.
5-იოდოინდოლით დამუშავებულ ჭიებში ასევე დაფიქსირდა ვაკუოლების აგრეგაცია და გახეთქვა (სურ. 5), რასაც ადასტურებს ჭიის მოხრა და გარემოში ვაკუოლების გამოყოფა. ვაკუოლების დარღვევა ასევე დაფიქსირდა კვერცხის ნაჭუჭის მემბრანაში, რომელიც ჩვეულებრივ L2-ის მიერ ხელუხლებლად ინახება გამოჩეკვის დროს (დამატებითი სურ. S2). ეს დაკვირვებები ადასტურებს სითხის დაგროვებისა და ოსმორეგულატორული უკმარისობის, ასევე შექცევადი უჯრედული დაზიანების (RCI) მონაწილეობას ვაკუოლების წარმოქმნისა და დაჩირქების პროცესში (სურ. 5).
დაკვირვებულ ვაკუოლების ფორმირებაში იოდის როლის ჰიპოთეზებით, ჩვენ გამოვიკვლიეთ ნატრიუმის იოდიდის (NaI) და კალიუმის იოდიდის (KI) ნემატიციდური აქტივობა. თუმცა, კონცენტრაციებზე (0.1, 0.5 ან 1 mM), მათ გავლენა არ მოუხდენიათ არც ნემატოდების გადარჩენაზე და არც ვაკუოლების ფორმირებაზე (დამატებითი სურ. S5), თუმცა 1 mM KI-ს ჰქონდა მცირე ნემატიციდური ეფექტი. მეორეს მხრივ, 7-იოდოინდოლმა (1 ან 2 mM), 5-იოდოინდოლის მსგავსად, გამოიწვია მრავალი ვაკუოლი და სტრუქტურული დეფორმაცია (დამატებითი სურ. S6). ორმა იოდოინდოლმა აჩვენა მსგავსი ფენოტიპური მახასიათებლები ფიჭვის ნემატოდებში, მაშინ როდესაც NaI-მ და KI-მ არა. საინტერესოა, რომ ინდოლმა არ გამოიწვია ვაკუოლების წარმოქმნა B. xylophilus-ში შემოწმებული კონცენტრაციებით (მონაცემები არ არის ნაჩვენები). ამრიგად, შედეგებმა დაადასტურა, რომ ინდოლ-იოდის კომპლექსი პასუხისმგებელია B. xylophilus-ის ვაკუოლიზაციასა და მეტაბოლიზმზე.
ნემატიციდური აქტივობის შესამოწმებლად შემოწმებულ ინდოლებს შორის, 5-იოდოინდოლს ჰქონდა ყველაზე მაღალი სრიალის ინდექსი -5.89 კკალ/მოლ, შემდეგ მოდიოდა 7-იოდოინდოლი (-4.48 კკალ/მოლ), 4-ფტორინდოლი (-4.33) და ინდოლი (-4.03) (სურათი 6). 5-იოდოინდოლის ძლიერი ხერხემლის წყალბადური ბმა ლეიცინ 218-თან ასტაბილურებს მის შეკავშირებას, მაშინ როდესაც ყველა სხვა ინდოლის წარმოებული უკავშირდება სერინ 260-ს გვერდითი ჯაჭვის წყალბადური ბმებით. სხვა მოდელირებულ იოდოინდოლებს შორის, 2-იოდოინდოლს აქვს -5.248 კკალ/მოლ შეკავშირების მნიშვნელობა, რაც განპირობებულია მისი ძირითადი წყალბადური ბმით ლეიცინ 218-თან. სხვა ცნობილი შეკავშირებებია 3-იოდოინდოლი (-4.3 კკალ/მოლ), 4-იოდოინდოლი (-4.0 კკალ/მოლ) და 6-ფტორინდოლი (-2.6 კკალ/მოლ) (დამატებითი სურათი S8). ჰალოგენირებული ინდოლების უმეტესობა და თავად ინდოლი, 5-იოდოინდოლისა და 2-იოდოინდოლის გარდა, სერინ 260-თან ბმას ქმნის. ის ფაქტი, რომ წყალბადის ბმა ლეიცინ 218-თან მიუთითებს რეცეპტორ-ლიგანდის ეფექტურ შეკავშირებაზე, როგორც ეს ივერმექტინის შემთხვევაში დაფიქსირდა (დამატებითი სურ. S7), ადასტურებს, რომ 5-იოდოინდოლი და 2-იოდოინდოლი, ივერმექტინის მსგავსად, მჭიდროდ უკავშირდება GluCL რეცეპტორის აქტიურ ცენტრს ლეიცინ 218-ის მეშვეობით (სურ. 6 და დამატებითი სურ. S8). ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ეს შეკავშირება აუცილებელია GluCL კომპლექსის ღია ფორების სტრუქტურის შესანარჩუნებლად და რომ GluCL რეცეპტორის აქტიურ ცენტრთან მჭიდრო შეკავშირებით, 5-იოდოინდოლი, 2-იოდოინდოლი, ავერმექტინი და ივერმექტინი ამგვარად ინარჩუნებენ იონურ არხს ღიას და სითხის შეწოვის საშუალებას.
ინდოლისა და ჰალოგენირებული ინდოლის მოლეკულური შეერთება GluCL-თან. (A) ინდოლის, (B) 4-ფტორინდოლის, (C) 7-იოდოინდოლის და (D) 5-იოდოინდოლის ლიგანდების შეკავშირების ორიენტაცია GluCL-ის აქტიურ უბანთან. ცილა წარმოდგენილია ლენტით, ხოლო ხერხემლის წყალბადური ბმები ნაჩვენებია ყვითელი წერტილოვანი ხაზებით. (A′), (B′), (C′) და (D′) აჩვენებს შესაბამისი ლიგანდების ურთიერთქმედებას მიმდებარე ამინომჟავის ნარჩენებთან, ხოლო გვერდითი ჯაჭვის წყალბადური ბმები მითითებულია ვარდისფერი წერტილოვანი ისრებით.
ექსპერიმენტები ჩატარდა კომბოსტოსა და ბოლოკის თესლის გაღივებაზე 5-იოდოინდოლის ტოქსიკური ეფექტის შესაფასებლად. 5-იოდოინდოლს (0.05 ან 0.1 მმ) ან ავერმექტინს (10 მკგ/მლ) მცირე ან საერთოდ არანაირი გავლენა არ მოუხდენია საწყის გაღივებასა და ნერგის აღმოცენებაზე (სურათი 7). გარდა ამისა, არ აღმოჩნდა მნიშვნელოვანი განსხვავება დაუმუშავებელი საკონტროლო ჯგუფისა და 5-იოდოინდოლით ან ავერმექტინით დამუშავებული თესლის გაღივების სიჩქარეს შორის. ფესვის დაგრძელებასა და წარმოქმნილი გვერდითი ფესვების რაოდენობაზე გავლენა უმნიშვნელო იყო, თუმცა 5-იოდოინდოლის 1 მმ-მა (მისი აქტიური კონცენტრაციის 10-ჯერ მეტი) ოდნავ შეაფერხა გვერდითი ფესვების განვითარება. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ 5-იოდოინდოლი არატოქსიკურია მცენარის უჯრედებისთვის და არ ერევა მცენარის განვითარების პროცესებში შესწავლილი კონცენტრაციებით.
5-იოდოინდოლის გავლენა თესლის აღმოცენებაზე. B. oleracea-სა და R. raphanistrum-ის თესლის აღმოცენება, გაღივება და გვერდითი დაფესვიანება მურაშიგესა და სკუგის აგარის გარემოში ავერმექტინის ან 5-იოდოინდოლის გამოყენებით ან მის გარეშე. აღმოცენება დაფიქსირდა 22°C ტემპერატურაზე 3-დღიანი ინკუბაციის შემდეგ.
ამ კვლევაში აღწერილია ინდოლებით ნემატოდების განადგურების რამდენიმე შემთხვევა. მნიშვნელოვანია, რომ ეს არის ფიჭვის ნემსებში იოდოინდოლის მიერ მეთილირების ინდუცირების პირველი შემთხვევა (პროცესი, რომელიც გამოწვეულია მცირე ვაკუოლების დაგროვებით, რომლებიც თანდათანობით უერთდებიან გიგანტურ ვაკუოლებს, რაც საბოლოოდ იწვევს მემბრანის გახეთქვას და სიკვდილს), სადაც იოდოინდოლი ავლენს მნიშვნელოვან ნემატიციდურ თვისებებს, მსგავსი კომერციული ნემატიციდის, ავერმექტინის თვისებებისა.
ადრე აღინიშნა, რომ ინდოლები ასრულებენ მრავალ სასიგნალო ფუნქციას პროკარიოტებსა და ეუკარიოტებში, მათ შორის ბიოაპკის ინჰიბირება/წარმოქმნა, ბაქტერიების გადარჩენა და პათოგენურობა19,32,33,34. ბოლო დროს, ჰალოგენიზებული ინდოლების, ინდოლის ალკალოიდების და ნახევრადსინთეზური ინდოლის წარმოებულების პოტენციურმა თერაპიულმა ეფექტებმა ფართო კვლევითი ინტერესი გამოიწვია35,36,37. მაგალითად, ჰალოგენიზებული ინდოლები კლავენ Escherichia coli-ს და Staphylococcus aureus-ის მუდმივ უჯრედებს37. გარდა ამისა, სამეცნიერო ინტერესს წარმოადგენს ჰალოგენიზებული ინდოლების ეფექტურობის შესწავლა სხვა სახეობების, გვარებისა და სამეფოების წინააღმდეგ და ეს კვლევა ამ მიზნის მიღწევისკენ გადადგმულ ნაბიჯს წარმოადგენს.
აქ ჩვენ ვთავაზობთ C. elegans-ში 5-იოდოინდოლით გამოწვეული ლეტალობის მექანიზმს, რომელიც დაფუძნებულია შექცევად უჯრედულ დაზიანებაზე (RCI) და მეთილირებაზე (სურათები 4C და 5). შეშუპებითი ცვლილებები, როგორიცაა შეშუპება და ვაკუოლური დეგენერაცია, RCI-სა და მეთილირების მაჩვენებლებია, რაც ციტოპლაზმაში გიგანტური ვაკუოლების სახით ვლინდება48,49. RCI ხელს უშლის ენერგიის გამომუშავებას ATP-ის გამომუშავების შემცირებით, რაც იწვევს ATP-აზას ტუმბოს უკმარისობას ან უჯრედის მემბრანების დარღვევით და Na+, Ca2+ და წყლის სწრაფი შემოდინების გამოწვევით50,51,52. ინტრაციტოპლაზმური ვაკუოლები წარმოიქმნება ცხოველურ უჯრედებში ციტოპლაზმაში სითხის დაგროვების შედეგად Ca2+ და წყლის შემოდინების გამო53. საინტერესოა, რომ უჯრედების დაზიანების ეს მექანიზმი შექცევადია, თუ დაზიანება დროებითია და უჯრედები გარკვეული პერიოდის განმავლობაში იწყებენ ATP-ის გამომუშავებას, მაგრამ თუ დაზიანება გრძელდება ან გაუარესდება, უჯრედები იღუპებიან.54 ჩვენი დაკვირვებები აჩვენებს, რომ 5-იოდოინდოლით დამუშავებული ნემატოდები ვერ აღადგენენ ნორმალურ ბიოსინთეზს სტრესული პირობების ზემოქმედების შემდეგ.
B. xylophilus-ში 5-იოდოინდოლით გამოწვეული მეთილირების ფენოტიპი შესაძლოა განპირობებული იყოს იოდის არსებობით და მისი მოლეკულური განაწილებით, რადგან 7-იოდოინდოლს B. xylophilus-ზე ნაკლები დამთრგუნველი ეფექტი ჰქონდა, ვიდრე 5-იოდოინდოლს (ცხრილი 1 და დამატებითი სურათი S6). ეს შედეგები ნაწილობრივ შეესაბამება Maltese et al. (2014)-ის კვლევებს, რომლებმაც აღნიშნეს, რომ ინდოლში პირიდილის აზოტის ფრაგმენტის ტრანსლოკაციამ პარა-დან მეტა- პოზიციაზე გააუქმა ვაკუოლიზაცია, ზრდის ინჰიბირება და ციტოტოქსიკურობა U251 უჯრედებში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ მოლეკულის ურთიერთქმედება ცილაში სპეციფიკურ აქტიურ ცენტრთან კრიტიკულია27,44,45. ამ კვლევაში დაფიქსირებული ინდოლს ან ჰალოგენირებულ ინდოლებსა და GluCL რეცეპტორებს შორის ურთიერთქმედება ასევე ადასტურებს ამ მოსაზრებას, რადგან 5- და 2-იოდოინდოლი უფრო ძლიერად უკავშირდება GluCL რეცეპტორებს, ვიდრე სხვა გამოკვლეული ინდოლები (სურათი 6 და დამატებითი სურათი S8). ინდოლის მეორე ან მეხუთე პოზიციაზე მდებარე იოდი GluCL რეცეპტორის ლეიცინ 218-ს უკავშირდება ხერხემლის წყალბადური ბმებით, მაშინ როდესაც სხვა ჰალოგენირებული ინდოლები და თავად ინდოლი სერინ 260-თან სუსტ გვერდით ჯაჭვურ წყალბადურ ბმებს წარმოქმნიან (სურათი 6). ამიტომ, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ჰალოგენის ლოკალიზაცია მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ვაკუოლური დეგენერაციის ინდუქციაში, მაშინ როდესაც 5-იოდოინდოლის მჭიდრო შეკავშირება იონურ არხს ღიას ინარჩუნებს, რითაც ხელს უწყობს სითხის სწრაფ შემოდინებას და ვაკუოლის გახეთქვას. თუმცა, 5-იოდოინდოლის მოქმედების დეტალური მექანიზმი ჯერ კიდევ დასადგენია.
5-იოდოინდოლის პრაქტიკულ გამოყენებამდე უნდა გაანალიზდეს მისი ტოქსიკური ეფექტი მცენარეებზე. ჩვენი თესლის აღმოცენების ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ შესწავლილი კონცენტრაციების შემთხვევაში 5-იოდოინდოლს არ ჰქონდა უარყოფითი გავლენა თესლის აღმოცენებაზე ან შემდგომ განვითარების პროცესებზე (სურათი 7). ამრიგად, ეს კვლევა იძლევა საფუძველს ეკოლოგიურ გარემოში 5-იოდოინდოლის გამოყენებისთვის ფიჭვის ნემატოდების ფიჭვის ხეებისთვის მავნებლობის კონტროლის მიზნით.
წინა ანგარიშებში ნაჩვენებია, რომ ინდოლზე დაფუძნებული თერაპია წარმოადგენს ანტიბიოტიკების მიმართ რეზისტენტობისა და კიბოს პროგრესირების პრობლემის გადაჭრის პოტენციურ მიდგომას55. გარდა ამისა, ინდოლებს აქვთ ანტიბაქტერიული, კიბოს საწინააღმდეგო, ანტიოქსიდანტური, ანთების საწინააღმდეგო, ანტიდიაბეტური, ანტივირუსული, ანტიპროლიფერაციული და ტუბერკულოზის საწინააღმდეგო აქტივობა და შეიძლება წარმოადგენდეს წამლის შემუშავების პერსპექტიულ საფუძველს56,57. ეს კვლევა პირველად მიუთითებს იოდის, როგორც ანტიპარაზიტული და ანტიჰელმინთური აგენტის პოტენციურ გამოყენებაზე.
ავერმექტინი სამი ათწლეულის წინ აღმოაჩინეს და 2015 წელს ნობელის პრემია მოიპოვა და მისი, როგორც ანტიჰელმინთური საშუალების გამოყენება დღემდე აქტიურად მიმდინარეობს. თუმცა, ნემატოდებსა და მავნებლებში ავერმექტინების მიმართ რეზისტენტობის სწრაფი განვითარების გამო, ფიჭვის ხეებში PWN ინფექციის კონტროლისთვის საჭიროა ალტერნატიული, დაბალფასიანი და ეკოლოგიურად სუფთა სტრატეგია. კვლევაში ასევე აღწერილია მექანიზმი, რომლითაც 5-იოდოინდოლი კლავს ფიჭვის ნემატოდებს და რომ 5-იოდოინდოლს აქვს დაბალი ტოქსიკურობა მცენარეული უჯრედებისთვის, რაც კარგ პერსპექტივებს ქმნის მისი სამომავლო კომერციული გამოყენებისთვის.
ყველა ექსპერიმენტი დამტკიცებული იყო კორეის ქალაქ კიონგსანის შტატის ქალაქ იუნგნამის უნივერსიტეტის ეთიკის კომიტეტის მიერ და მეთოდები შესრულდა იუნგნამის უნივერსიტეტის ეთიკის კომიტეტის მითითებების შესაბამისად.
კვერცხების ინკუბაციის ექსპერიმენტები ჩატარდა დადგენილი პროცედურების გამოყენებით43. გამოჩეკვის სიჩქარის (HR) შესაფასებლად, 1 დღის ზრდასრული ნემატოდები (დაახლოებით 100 დედალი და 100 მამრი) გადაიტანეს სოკოს შემცველ პეტრის ჭურჭელში და 24 საათის განმავლობაში ზრდის საშუალება მისცეს. შემდეგ კვერცხები იზოლირებული იქნა და დამუშავდა 5-იოდოინდოლით (0.05 mM და 0.1 mM) ან ავერმექტინით (10 μg/მლ) სტერილურ გამოხდილ წყალში სუსპენზიის სახით. ეს სუსპენზიები (500 μl; დაახლოებით 100 კვერცხი) გადაიტანეს 24-ჭერიანი ქსოვილის კულტურის ფირფიტის ჭურჭელში და ინკუბირებული იქნა 22°C ტემპერატურაზე. L2 დათვლა განხორციელდა 24 საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, მაგრამ მკვდრად ითვლებოდა, თუ უჯრედები არ მოძრაობდნენ წვრილი პლატინის მავთულით სტიმულაციისას. ეს ექსპერიმენტი ჩატარდა ორ ეტაპად, თითოეული ექვსი გამეორებით. ორივე ექსპერიმენტის მონაცემები გაერთიანდა და წარმოდგენილი იქნა. HR-ის პროცენტული მაჩვენებელი გამოითვლება შემდეგნაირად:
ლარვების სიკვდილიანობა შეფასდა ადრე შემუშავებული პროცედურების გამოყენებით. ნემატოდების კვერცხები შეგროვდა და ემბრიონები სინქრონიზებული იქნა სტერილურ გამოხდილ წყალში გამოჩეკით L2 სტადიის ლარვების მისაღებად. სინქრონიზებული ლარვები (დაახლოებით 500 ნემატოდი) დამუშავდა 5-იოდოინდოლით (0.05 mM და 0.1 mM) ან ავერმექტინით (10 μg/მლ) და გაიზარდა B. cinerea Petri-ს ფირფიტებზე. 22°C ტემპერატურაზე 48 საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, ნემატოდები შეგროვდა სტერილურ გამოხდილ წყალში და შემოწმდა L2, L3 და L4 სტადიების არსებობაზე. L3 და L4 სტადიების არსებობა მიუთითებდა ლარვის ტრანსფორმაციაზე, ხოლო L2 სტადიის არსებობა ტრანსფორმაციის არარსებობაზე. სურათები მიღებული იქნა iRiS™ ციფრული უჯრედული ვიზუალიზაციის სისტემის გამოყენებით. ეს ექსპერიმენტი ჩატარდა ორ ეტაპად, თითოეული ექვსი გამეორებით. ორივე ექსპერიმენტიდან მიღებული მონაცემები გაერთიანდა და წარმოდგენილი იქნა.
5-იოდოინდოლისა და ავერმექტინის ტოქსიკურობა თესლისთვის შეფასდა მურაშიგესა და სკუგის აგარის ფირფიტებზე ჩატარებული აღმოცენების ტესტების გამოყენებით.62 B. oleracea-სა და R. raphanistrum-ის თესლი თავდაპირველად ერთი დღის განმავლობაში სტერილურ გამოხდილ წყალში დაალბეს, შემდეგ 1 მლ 100%-იანი ეთანოლით გაირეცხა, 15 წუთის განმავლობაში 1 მლ 50%-იანი კომერციული მათეთრებლით (3% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტი) გაასტერილეს და ხუთჯერ 1 მლ სტერილური წყლით გაირეცხა. შემდეგ სტერილიზებული თესლი დააწექით აღმოცენების აგარის ფირფიტებზე, რომლებიც შეიცავდა 0.86 გ/ლ (0.2X) მურაშიგესა და სკუგის გარემოს და 0.7%-იან ბაქტერიოლოგიურ აგარს 5-იოდოინდოლით ან ავერმექტინით ან მის გარეშე. შემდეგ ფირფიტები ინკუბირებული იქნა 22°C ტემპერატურაზე და 3-დღიანი ინკუბაციის შემდეგ გადაიღეს სურათები. ეს ექსპერიმენტი ჩატარდა ორ ეტაპად, რომელთაგან თითოეული ექვსი გამეორებით შედგებოდა.