გენომის მასშტაბური ასოციაციის ანალიზი MAMP-ით გამოწვეული თავდაცვითი რეაქციის სიძლიერისა და სორგოში ფოთლის სამიზნე ლაქისადმი წინააღმდეგობის შესახებ

მცენარეული და პათოგენური მასალები

სორგოს ასოციაციის რუკების პოპულაცია, რომელიც ცნობილია როგორც სორგოს გარდაქმნის პოპულაცია (SCP) მოწოდებული იყო დოქტორი პეტ ბრაუნის მიერ ილინოისის უნივერსიტეტში (ამჟამად UC Davis-ში). ეს უკვე აღწერილია ადრე და წარმოადგენს სხვადასხვა ხაზების კრებულს, რომელიც გარდაიქმნება ფოტოპერიოდულ-უგრძნობელობად და უფრო მცირე სიმაღლით, რათა ხელი შეუწყოს მცენარეების ზრდას და განვითარებას აშშ-ს გარემოში. ამ პოპულაციის 510 ხაზი იქნა გამოყენებული ამ კვლევაში, თუმცა ცუდი გაღივების და ხარისხის კონტროლის სხვა საკითხების გამო, ყველა ხაზი არ იყო გამოყენებული სამივე მახასიათებლის ანალიზში. საბოლოო ჯამში, 345 ხაზის მონაცემები გამოყენებული იქნა ქიტინის პასუხის ანალიზისთვის, 472 ხაზი flg22 პასუხისთვის და 456 TLS რეზისტენტობისთვის.B. cookeiშტამი LSLP18 მიღებული იყო დოქტორ ბურტ ბლუმისგან არკანზასის უნივერსიტეტიდან.

MAMP პასუხის გაზომვა

ორი განსხვავებული MAMP იყო გამოყენებული ამ კვლევაში flg22, (Genscript კატალოგი# RP19986) და ქიტინი. სორგოს მცენარეები იზრდებოდა სათბურში ნიადაგით სავსე ბინებზე (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) ჩანართებში. მცენარეები მორწყეს ნიმუშის შეგროვებამდე ერთი დღით ადრე, რათა თავიდან აიცილონ ფოთლების ზედმეტი ტენიანობა შეგროვების დღეს.

ხაზები რანდომიზირებული იყო და, ლოგისტიკური მიზეზების გამო, დარგეს 60 ზოლიან პარტიებად. თითოეული ხაზისთვის დარგეს სამი „ქოთანი“, თითო სტრიქონზე ორი თესლით. შემდგომი პარტიები დარგეს, როგორც კი წინა პარტია დამუშავდა, სანამ მთლიანი პოპულაცია არ შეფასდებოდა. ჩატარდა ორი ექსპერიმენტული პერსპექტივა ორივე MAMP-სთვის გენოტიპებით ხელახლა რანდომიზირებული თითოეულ ორ პერსპექტივაში.

ROS ანალიზები ჩატარდა ადრე აღწერილი მეთოდით. ​​მოკლედ, თითოეული ხაზისთვის ექვსი თესლი დაირგო 3 სხვადასხვა ქოთანში. მიღებული ნერგებიდან სამი შეირჩა ერთგვაროვნების მიხედვით. არ გამოიყენებოდა უჩვეულოდ გამოიყურებოდა ან მნიშვნელოვნად მაღალი ან დაბალი იყო, ვიდრე უმრავლესობა. სამი განსხვავებული 15 დღის სორგოს მცენარის მე-4 ფოთლის ყველაზე ფართო ნაწილიდან ამოიღეს 3 მმ დიამეტრის ოთხი ფოთლის დისკი. ორი მცენარის თითო ფოთოლზე ერთი დისკი და ერთი მცენარის ორი დისკი, მეორე დისკი კი წყლის საკონტროლო საშუალებად იქცა (იხილეთ ქვემოთ). დისკები ინდივიდუალურად მოათავსეს 50 µლ H20-ზე შავ 96-ჭერიან ფირფიტაში, დალუქეს ალუმინის დალუქვით სინათლის ზემოქმედების თავიდან ასაცილებლად და შეინახეს ოთახის ტემპერატურაზე მთელი ღამით. მეორე დილით რეაქციის ხსნარი მომზადდა 2 მგ/მლ ქემილუმინესცენტური ზონდის L-012 (Wako, კატალოგი # 120-04891), 2 მგ/მლ ხრენის პეროქსიდაზას (ტიპი VI-A, Sigma-Aldrich, კატალოგი # P6782) და 100 მგ/მლ ქიტინის ან Flg22-ის 2 μM გამოყენებით. ამ რეაქციის ხსნარის 50 მკლ დაემატა ოთხიდან სამ ჭაში. მეოთხე ჭა იყო საკონტროლო ტესტი, რომელსაც დაემატა რეაქციის ხსნარი MAMP-ის გამოკლებით. თითოეულ ფირფიტაში ასევე შედიოდა ოთხი ცარიელი ჭა, რომლებიც მხოლოდ წყალს შეიცავდა.

რეაქციის ხსნარის დამატების შემდეგ, ლუმინესცენცია იზომებოდა SynergyTM 2 მრავალჯერადი აღმოჩენის მიკროპლატის წამკითხველის (BioTek) გამოყენებით ყოველ 2 წუთში 1 საათის განმავლობაში. ფირფიტის მკითხველი იღებს ლუმინესცენციის გაზომვას ყოველ 2 წუთში ამ 1 საათის განმავლობაში. 31-ვე წაკითხვის ჯამი გამოითვალა თითოეული ჭაბურღილის მნიშვნელობის მისაცემად. MAMP პასუხის სავარაუდო მნიშვნელობა თითოეული გენოტიპისთვის გამოთვლილი იყო როგორც (სამი ექსპერიმენტული ჭაბურღილის საშუალო ლუმინესცენციის მნიშვნელობა - იმიტირებული ჭაბურღილის მნიშვნელობა) - მინუს საშუალო ცარიელი ჭაბურღილის მნიშვნელობა. ცარიელი ჭაბურღილის მნიშვნელობები თანმიმდევრულად ახლოს იყო ნულთან.

ფოთლის დისკებინიკოტიანა ბენთამიანა, ერთი მაღალი რეაგირების სორგოს ხაზი (SC0003) და ერთი დაბალი პასუხისმგებლობის მქონე სორგოს ხაზი (PI 6069) ასევე ჩართული იყო როგორც კონტროლი თითოეულ 96 ჭაბურღილ ფირფიტაში ხარისხის კონტროლის მიზნით.

B. cookeiინოკულუმის მომზადება და ინოკულაცია

B. cookeiინოკულუმი მომზადდა ისე, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი. მოკლედ, სორგოს მარცვლები გაჟღენთილია წყალში სამი დღის განმავლობაში, ჩამოიბანეთ, ჩაასხით 1 ლიტრიანი კონუსურ კოლბაში და ავტოკლავდებოდნენ ერთი საათის განმავლობაში 15 psi და 121 °C ტემპერატურაზე. შემდეგ მარცვლები დათესეს დაახლოებით 5 მლ მაცერირებული მიცელიით ახალი კულტურისგანB. cookeiLSLP18 იზოლირებულია და დატოვეთ 2 კვირის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, კოლბების შერყევა ყოველ 3 დღეში. 2 კვირის შემდეგ, სოკოთი დაავადებული სორგოს მარცვლები გაშრეს ჰაერში და შემდეგ ინახებოდეს 4 °C ტემპერატურაზე მინდვრის ინოკულაციამდე. იგივე ინოკულუმი გამოიყენებოდა მთელი საცდელი პერიოდისთვის და ყოველწლიურად ახლდა. ინოკულაციისთვის, 6-10 დაინფიცირებული მარცვალი მოთავსდა 4-5 კვირის ასაკის სორგოს მცენარეებში. ამ სოკოებისგან წარმოქმნილმა სპორებმა ერთი კვირის განმავლობაში ინფექცია გამოიწვია ახალგაზრდა სორგოს მცენარეებში.

თესლის მომზადება

მინდორში დარგვამდე სორგოს თესლი დამუშავებული იყო ფუნგიციდით, ინსექტიციდით და დამცავი ნარევით, რომელიც შეიცავს ~ 1% Spirato 480 FS ფუნგიციდს, 4% Sebring 480 FS ფუნგიციდს, 3% Sorpro 940 ES თესლის დამცავ საშუალებებს. შემდეგ თესლს აშრობდნენ ჰაერში 3 დღის განმავლობაში, რაც ამ ნაზავის თხელ ფენას წარმოადგენდა თესლის გარშემო. დამცავი საშუალება იძლეოდა ჰერბიციდის Dual Magnum-ის გამოყენებას, როგორც გაჩენის წინსვლას.

სამიზნე ფოთლის ლაქის წინააღმდეგობის შეფასება

SCP დარგეს კულტურების ცენტრალურ კვლევით სადგურზე კლეიტონში, NC 2017 წლის 14–15 ივნისს და 2018 წლის 20 ივნისს რანდომიზებული სრული ბლოკის დიზაინით, თითოეულ შემთხვევაში ორი ექსპერიმენტული გამეორებით. ექსპერიმენტები დარგეს 1,8 მ სიგრძის ერთ მწკრივად 0,9 მ მწკრივის სიგანეზე 10 თესლის გამოყენებით ნაკვეთზე. ორი სასაზღვრო მწკრივი დარგეს თითოეული ექსპერიმენტის პერიფერიაზე, რათა თავიდან აიცილონ კიდეების ეფექტები. ექსპერიმენტები ჩაუნერგეს 2017 წლის 20 ივლისს და 2018 წლის 20 ივლისს, რა დროსაც სორგოს მცენარეები იმყოფებოდნენ ზრდის 3 სტადიაზე. რეიტინგები აღებული იყო ერთიდან ცხრა მასშტაბით, სადაც მცენარეები, რომლებიც არ აჩვენებდნენ დაავადების ნიშანს, შეფასდა როგორც ცხრა, ხოლო მთლიანად მკვდარი მცენარეები შეფასდა როგორც ერთი. ორი შეფასება იქნა აღებული 2017 წელს და ოთხი კითხვა 2018 წელს ყოველწლიურად ინოკულაციის შემდეგ ორი კვირის შემდეგ. sAUDPC (სტანდარტიზებული ფართობი დაავადების პროგრესირების მრუდის ქვეშ) გამოითვალა, როგორც ადრე იყო აღწერილი.