მდოგვის ზრდის რეგულაციის ფაქტორების გენომის იდენტიფიკაცია და გამოხატვის ანალიზი გვალვის პირობებში

ნალექების სეზონური განაწილება გუიჯოუს პროვინციაში არათანაბარია, უფრო მეტი ნალექია გაზაფხულზე და ზაფხულში, მაგრამ რაფსის ნერგები მგრძნობიარეა გვალვის მიმართ შემოდგომაზე და ზამთარში, რაც სერიოზულად მოქმედებს მოსავლიანობაზე. მდოგვი არის სპეციალური ზეთოვანი კულტურა, რომელიც ძირითადად იზრდება გუიჯოუს პროვინციაში. მას აქვს ძლიერი გვალვაგამძლეობა და შეიძლება გაიზარდოს მთიან რაიონებში. ეს არის გვალვაგამძლე გენების მდიდარი რესურსი. გვალვაგამძლე გენების აღმოჩენას კრიტიკული მნიშვნელობა აქვს მდოგვის ჯიშების გასაუმჯობესებლად. და ინოვაცია გერპლაზმის რესურსებში. GRF ოჯახი გადამწყვეტ როლს თამაშობს მცენარის ზრდა-განვითარებაში და გვალვის სტრესზე რეაგირებაში. ამჟამად, GRF გენები ნაპოვნია Arabidopsis 2, ბრინჯი (Oryza sativa) 12, რაფსის თესლი 13, ბამბა (Gossypium hirsutum) 14, ხორბალი (Triticum). aestivum)15, მარგალიტის ფეტვი (Setaria italica)16 და Brassica17, მაგრამ არ არის შეტყობინებები GRF გენების გამოვლენილი მდოგვის შესახებ. ამ კვლევაში მდოგვის GRF ოჯახის გენები იდენტიფიცირებული იყო გენომის მასშტაბით და გაანალიზდა მათი ფიზიკური და ქიმიური მახასიათებლები, ევოლუციური ურთიერთობები, ჰომოლოგია, კონსერვირებული მოტივები, გენის სტრუქტურა, გენის დუბლირება, cis-ელემენტები და ნერგების სტადია (ოთხფოთლიანი ეტაპი). გვალვის სტრესის პირობებში გამოხატვის ნიმუშები ყოვლისმომცველი იყო გაანალიზებული, რათა შემდგომი გამოკვლევები ყოფილიყო BjGRF გენების პოტენციური ფუნქციის შესახებ გვალვის რეაქციაში და უზრუნველყოს კანდიდატი გენები გვალვისადმი ტოლერანტული მდოგვის მოსაშენებლად.
34 BjGRF გენი იდენტიფიცირებული იყო Brassica juncea-ს გენომში ორი HMMER ძიების გამოყენებით, რომლებიც შეიცავს QLQ და WRC დომენებს. იდენტიფიცირებული BjGRF გენების CDS თანმიმდევრობები წარმოდგენილია დამატებით ცხრილში S1. BjGRF01–BjGRF34 დასახელებულია მათი მდებარეობის მიხედვით ქრომოსომაზე. ამ ოჯახის ფიზიკურ-ქიმიური თვისებები მიუთითებს იმაზე, რომ ამინომჟავის სიგრძე ძალიან ცვალებადია და მერყეობს 261 aa-დან (BjGRF19) 905 aa-მდე (BjGRF28). BjGRF-ის იზოელექტრული წერტილი მერყეობს 6,19-დან (BjGRF02)-დან 9,35-მდე (BjGRF03) საშუალოდ 8,33-ით და BjGRF-ის 88,24% არის ძირითადი ცილა. BjGRF-ის პროგნოზირებული მოლეკულური წონის დიაპაზონი არის 29,82 kDa-დან (BjGRF19) 102,90 kDa-მდე (BjGRF28); BjGRF ცილების არასტაბილურობის ინდექსი მერყეობს 51,13-დან (BjGRF08)-დან 78,24-მდე (BjGRF19), ყველა 40-ზე მეტია, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ცხიმოვანი მჟავების ინდექსი მერყეობს 43,65-დან (BjGRF01)-დან 78,78-მდე (BjGRFY1-ის საშუალო სიხშირე 22-დან). (BjGRF31) -0,45-მდე (BjGRF22), ყველა ჰიდროფილურ BjGRF ცილას აქვს უარყოფითი GRAVY მნიშვნელობები, რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს ნარჩენებით გამოწვეული ჰიდროფობიურობის ნაკლებობით. სუბუჯრედული ლოკალიზაციის პროგნოზმა აჩვენა, რომ 31 BjGRF კოდირებული ცილა შეიძლება ლოკალიზებული იყოს ბირთვში, BjGRF04 შეიძლება იყოს ლოკალიზებული პეროქსიზომებში, BjGRF25 შეიძლება იყოს ლოკალიზებული ციტოპლაზმაში და BjGRF28 შეიძლება ლოკალიზებული იყოს ქლოროპლასტებში (ცხრილი 1), რაც მიუთითებს, რომ BjGRF შეიძლება იყოს ლოკალიზებული ლოკალიზაცია და GRFj როლი, როგორც ტრანსკრიფციის ფაქტორი.
GRF ოჯახების ფილოგენეტიკური ანალიზი სხვადასხვა სახეობებში დაგეხმარებათ გენების ფუნქციების შესწავლაში. ამიტომ, 35 რაფსის თესლის, 16 ტურპის, 12 ბრინჯის, 10 ფეტვის და 9 Arabidopsis GRF-ის სრული სიგრძის ამინომჟავების თანმიმდევრობა გადმოწერილი იყო და ფილოგენეტიკური ხე აშენდა 34 იდენტიფიცირებული BjGRF გენის საფუძველზე (ნახ. 1). სამი ქვეოჯახი შეიცავს სხვადასხვა რაოდენობის წევრებს; 116 GRF TF იყოფა სამ განსხვავებულ ქვეოჯახად (ჯგუფები A~C), რომლებიც შეიცავს GRF-ების 59 (50.86%), 34 (29.31%) და 23 (19.83)% შესაბამისად. მათ შორის BjGRF ოჯახის 34 წევრი გაბნეულია 3 ქვეოჯახში: 13 წევრი A ჯგუფში (38,24%), 12 წევრი B ჯგუფში (35,29%) და 9 წევრი C ჯგუფში (26,47%). მდოგვის პოლიპლოიდიზაციის პროცესში BjGRFs გენების რაოდენობა სხვადასხვა ქვეოჯახებში განსხვავებულია და შესაძლოა ადგილი ჰქონდეს გენის გაძლიერებას და დაკარგვას. აღსანიშნავია, რომ ბრინჯისა და ფეტვის GRF-ების განაწილება C ჯგუფში არ არის, მაშინ როცა B ჯგუფში არის 2 ბრინჯის GRF და 1 ფეტვის GRF და ბრინჯისა და ფეტვის GRF-ების უმეტესობა დაჯგუფებულია ერთ ტოტში, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ BjGRF მჭიდროდ არის დაკავშირებული დიქოტებთან. მათ შორის, ყველაზე სიღრმისეული კვლევები GRF ფუნქციის შესახებ Arabidopsis thaliana-ში იძლევა საფუძველს BjGRF-ების ფუნქციური კვლევებისთვის.
მდოგვის ფილოგენეტიკური ხე, მათ შორის Brassica napus, Brassica napus, ბრინჯი, ფეტვი და Arabidopsis thaliana GRF ოჯახის წევრები.
მდოგვის GRF ოჯახში განმეორებადი გენების ანალიზი. ფონზე ნაცრისფერი ხაზი წარმოადგენს სინქრონიზებულ ბლოკს მდოგვის გენომში, წითელი ხაზი წარმოადგენს BjGRF გენის სეგმენტირებული გამეორებების წყვილს;
BjGRF გენის ექსპრესია გვალვის სტრესის პირობებში მეოთხე ფოთლის ეტაპზე. qRT-PCR მონაცემები ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში S5. მონაცემების მნიშვნელოვანი განსხვავებები მითითებულია მცირე ასოებით.
გლობალური კლიმატის ცვლილებასთან ერთად, კულტურების შესწავლა, თუ როგორ უმკლავდებიან გვალვის სტრესს და აუმჯობესებენ ტოლერანტობის მექანიზმებს, გახდა კვლევის ცხელი თემა18. გვალვის შემდეგ შეიცვლება მცენარეების მორფოლოგიური სტრუქტურა, გენის გამოხატულება და მეტაბოლური პროცესები, რამაც შესაძლოა გამოიწვიოს ფოტოსინთეზის შეწყვეტა და ნივთიერებათა ცვლის დარღვევა, რაც გავლენას მოახდენს მოსავლის მოსავლიანობასა და ხარისხზე19,20,21. როდესაც მცენარეები გრძნობენ გვალვის სიგნალებს, ისინი წარმოქმნიან მეორე მესინჯერებს, როგორიცაა Ca2+ და ფოსფატიდილინოზიტოლი, ზრდის კალციუმის იონების უჯრედშიდა კონცენტრაციას და ააქტიურებს ცილის ფოსფორილირების გზის მარეგულირებელ ქსელს22,23. საბოლოო სამიზნე ცილა უშუალოდ მონაწილეობს უჯრედების დაცვაში ან არეგულირებს დაკავშირებული სტრესის გენების გამოხატვას TF-ების მეშვეობით, აძლიერებს მცენარეთა ტოლერანტობას სტრესის მიმართ24,25. ამრიგად, TF-ები გადამწყვეტ როლს თამაშობენ გვალვის სტრესზე რეაგირებაში. გვალვის სტრესისადმი მგრძნობიარე TF-ების თანმიმდევრობისა და დნმ-ის დამაკავშირებელი თვისებების მიხედვით, TFs შეიძლება დაიყოს სხვადასხვა ოჯახებად, როგორიცაა GRF, ERF, MYB, WRKY და სხვა ოჯახები26.
GRF გენების ოჯახი არის მცენარეებისთვის სპეციფიკური TF-ის ტიპი, რომელიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებს სხვადასხვა ასპექტებში, როგორიცაა ზრდა, განვითარება, სიგნალის გადაცემა და მცენარეთა თავდაცვის პასუხები27. მას შემდეგ, რაც პირველი GRF გენი გამოვლინდა O. sativa28-ში, უფრო და უფრო მეტი GRF გენი იდენტიფიცირებულია ბევრ სახეობაში და ნაჩვენებია, რომ გავლენას ახდენს მცენარეთა ზრდაზე, განვითარებაზე და სტრესზე რეაგირებაზე8, 29, 30,31,32. Brassica juncea-ს გენომის თანმიმდევრობის გამოქვეყნებით შესაძლებელი გახდა BjGRF გენის ოჯახის იდენტიფიცირება33. ამ კვლევაში, 34 BjGRF გენი იდენტიფიცირებული იყო მდოგვის მთელ გენომში და დაარქვეს BjGRF01–BjGRF34 მათი ქრომოსომული პოზიციიდან გამომდინარე. ყველა მათგანი შეიცავს უაღრესად დაკონსერვებულ QLQ და WRC დომენებს. ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების ანალიზმა აჩვენა, რომ BjGRF ცილების ამინომჟავების რაოდენობასა და მოლეკულურ წონაში განსხვავებები (გარდა BjGRF28) არ იყო მნიშვნელოვანი, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ BjGRF ოჯახის წევრებს შეიძლება ჰქონდეთ მსგავსი ფუნქციები. გენის სტრუქტურის ანალიზმა აჩვენა, რომ BjGRF გენების 64.7% შეიცავდა 4 ეგზონს, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ BjGRF გენის სტრუქტურა შედარებით შენარჩუნებულია ევოლუციაში, მაგრამ BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 და BjGRF29 გენებში ეგზონების რაოდენობა უფრო დიდია. კვლევებმა აჩვენა, რომ ეგზონების ან ინტრონების დამატება ან წაშლა შეიძლება გამოიწვიოს განსხვავებები გენის სტრუქტურასა და ფუნქციაში, რითაც შეიქმნას ახალი გენები34,35,36. აქედან გამომდინარე, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ BjGRF-ის ინტრონი დაიკარგა ევოლუციის დროს, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს გენის ფუნქციის ცვლილებები. არსებული კვლევების შესაბამისად, ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ინტრონების რაოდენობა დაკავშირებული იყო გენის ექსპრესიასთან. როდესაც გენში ინტრონების რაოდენობა დიდია, გენს შეუძლია სწრაფად რეაგირება სხვადასხვა არახელსაყრელ ფაქტორებზე.
გენის გაორმაგება არის გენომიური და გენეტიკური ევოლუციის მთავარი ფაქტორი37. დაკავშირებულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ გენების დუბლირება არა მხოლოდ ზრდის GRF გენების რაოდენობას, არამედ ემსახურება როგორც ახალი გენების გენერირების საშუალებას, რათა დაეხმაროს მცენარეებს ადაპტირდნენ სხვადასხვა არახელსაყრელ გარემო პირობებთან38. სულ 48 დუბლიკატი გენის წყვილი იქნა ნაპოვნი ამ კვლევაში, ყველა მათგანი იყო სეგმენტური დუბლირება, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ სეგმენტური დუბლირება არის მთავარი მექანიზმი ამ ოჯახში გენების რაოდენობის გაზრდისთვის. ლიტერატურაში მოხსენებულია, რომ სეგმენტურ დუბლირებას შეუძლია ეფექტურად შეუწყოს ხელი GRF გენის ოჯახის წევრების გაძლიერებას Arabidopsis-სა და მარწყვში და ამ გენების ოჯახის ტანდემური დუბლირება არცერთ სახეობაში არ იქნა ნაპოვნი27,39. ამ კვლევის შედეგები შეესაბამება Arabidopsis thaliana-სა და მარწყვის ოჯახებზე არსებულ კვლევებს, რაც ვარაუდობს, რომ GRF ოჯახს შეუძლია გაზარდოს გენების რაოდენობა და წარმოქმნას ახალი გენები სეგმენტური დუბლირების გზით სხვადასხვა მცენარეებში.
ამ კვლევაში სულ 34 BjGRF გენი იქნა გამოვლენილი მდოგვის შემადგენლობაში, რომლებიც დაყოფილი იყო 3 ქვეოჯახად. ამ გენებმა აჩვენეს მსგავსი შენარჩუნებული მოტივები და გენის სტრუქტურები. კოლინარობის ანალიზმა გამოავლინა 48 წყვილი სეგმენტის დუბლირება მდოგვში. BjGRF პრომოტორული რეგიონი შეიცავს ცის-მოქმედ ელემენტებს, რომლებიც დაკავშირებულია სინათლის რეაქციასთან, ჰორმონალურ პასუხთან, გარემო სტრესის რეაქციასთან და ზრდა-განვითარებასთან. 34 BjGRF გენის ექსპრესია გამოვლინდა მდოგვის ნერგების ეტაპზე (ფესვები, ღეროები, ფოთლები) და 10 BjGRF გენის ექსპრესიის ნიმუში გვალვის პირობებში. აღმოჩნდა, რომ BjGRF გენების გამოხატვის ნიმუშები გვალვის სტრესის ქვეშ იყო მსგავსი და შეიძლება იყოს მსგავსი. გვალვაში ჩართვა Forcing რეგულირება. BjGRF03 და BjGRF32 გენებს შეუძლიათ დადებითი მარეგულირებელი როლი შეასრულონ გვალვის სტრესში, ხოლო BjGRF06 და BjGRF23 როლებს თამაშობენ გვალვის სტრესში, როგორც miR396 სამიზნე გენები. მთლიანობაში, ჩვენი კვლევა იძლევა ბიოლოგიურ საფუძველს BjGRF გენის ფუნქციის მომავალი აღმოჩენისთვის Brassicaceae მცენარეებში.
ამ ექსპერიმენტში გამოყენებული მდოგვის თესლი მოწოდებული იქნა გუიჯოუს ზეთის თესლის კვლევის ინსტიტუტის მიერ, გუიჯოუს სოფლის მეურნეობის მეცნიერებათა აკადემია. ამოარჩიეთ მთლიანი თესლი და დარგეთ მიწაში (სუბსტრატი: ნიადაგი = 3:1), ხოლო ფესვები, ღეროები და ფოთლები შეაგროვეთ ოთხფოთლიანი ეტაპის შემდეგ. მცენარეები დამუშავდა 20% PEG 6000-ით გვალვის სიმულაციისთვის, ხოლო ფოთლები შეგროვდა 0, 3, 6, 12 და 24 საათის შემდეგ. მცენარის ყველა ნიმუში დაუყოვნებლივ გაიყინა თხევად აზოტში და შემდეგ ინახებოდა -80°C საყინულეში შემდეგი ტესტისთვის.
ამ კვლევის დროს მიღებული ან გაანალიზებული ყველა მონაცემი შედის გამოქვეყნებულ სტატიაში და დამატებით საინფორმაციო ფაილებში.