გვალვის პირობებში მდოგვის ზრდის რეგულირების ფაქტორების გენომის მასშტაბით იდენტიფიკაცია და ექსპრესიის ანალიზი

გუიჯოუს პროვინციაში ნალექების სეზონური განაწილება არათანაბარია, გაზაფხულსა და ზაფხულში მეტი ნალექია, თუმცა რაფსის ნერგები შემოდგომაზე და ზამთარში გვალვის სტრესის მიმართ მგრძნობიარეა, რაც სერიოზულად მოქმედებს მოსავლიანობაზე. მდოგვი განსაკუთრებული ზეთოვანი კულტურაა, რომელიც ძირითადად გუიჯოუს პროვინციაში მოჰყავთ. მას გვალვაგამძლეობის ძლიერი ტოლერანტობა აქვს და მისი მოყვანა მთიან რაიონებშიც შეიძლება. ის გვალვაგამძლე გენების მდიდარი რესურსია. გვალვაგამძლე გენების აღმოჩენას კრიტიკული მნიშვნელობა აქვს მდოგვის ჯიშების გაუმჯობესებისა და გერმპლაზმური რესურსების ინოვაციისთვის. GRF ოჯახი კრიტიკულ როლს ასრულებს მცენარეთა ზრდა-განვითარებასა და გვალვაგამძლე სტრესზე რეაგირებაში. ამჟამად, GRF გენები აღმოჩენილია Arabidopsis 2-ში, ბრინჯში (Oryza sativa) 12, რაფსის 13, ბამბაში (Gossypium hirsutum) 14, ხორბალში (Triticum aestivum) 15, ფეტვის ფოთლებში (Setaria italica) 16 და Brassica 17, თუმცა მდოგვში GRF გენების აღმოჩენის შესახებ ცნობები არ არსებობს. ამ კვლევაში, მდოგვის GRF ოჯახის გენები იდენტიფიცირებული იქნა გენომის მასშტაბით დონეზე და გაანალიზდა მათი ფიზიკური და ქიმიური მახასიათებლები, ევოლუციური ურთიერთობები, ჰომოლოგია, კონსერვირებული მოტივები, გენის სტრუქტურა, გენების დუბლირება, cis-ელემენტები და ნერგის სტადია (ოთხფოთლიანი სტადია). გვალვის სტრესის ქვეშ ექსპრესიის ნიმუშები ყოვლისმომცველად იქნა გაანალიზებული, რათა სამეცნიერო საფუძველი ჩაეყარა გვალვაზე რეაგირებაში BjGRF გენების პოტენციური ფუნქციის შესახებ შემდგომი კვლევებისთვის და გვალვაგამძლე მდოგვის გამოყვანის კანდიდატი გენების მოსაყვანად.
Brassica juncea-ს გენომში ორი HMMER ძიების გამოყენებით ოცდათოთხმეტი BjGRF გენი იქნა იდენტიფიცირებული, რომელთაგან თითოეული შეიცავს QLQ და WRC დომენებს. იდენტიფიცირებული BjGRF გენების CDS თანმიმდევრობები წარმოდგენილია დამატებით ცხრილში S1. BjGRF01–BjGRF34 დასახელებულია ქრომოსომაზე მათი მდებარეობის მიხედვით. ამ ოჯახის ფიზიკურ-ქიმიური თვისებები მიუთითებს, რომ ამინომჟავის სიგრძე ძალიან ცვალებადია, მერყეობს 261 ა-დან (BjGRF19) 905 ა-მდე (BjGRF28). BjGRF-ის იზოელექტრული წერტილი მერყეობს 6.19-დან (BjGRF02) 9.35-მდე (BjGRF03), საშუალოდ 8.33-ით, ხოლო BjGRF-ის 88.24% არის ფუძე ცილა. BjGRF-ის პროგნოზირებული მოლეკულური წონის დიაპაზონი არის 29.82 kDa-დან (BjGRF19) 102.90 kDa-მდე (BjGRF28); BjGRF ცილების არასტაბილურობის ინდექსი მერყეობს 51.13-დან (BjGRF08) 78.24-მდე (BjGRF19), ყველა მათგანი 40-ზე მეტია, რაც მიუთითებს, რომ ცხიმოვანი მჟავების ინდექსი მერყეობს 43.65-დან (BjGRF01) 78.78-მდე (BjGRF22), საშუალო ჰიდროფილურობა (GRAVY) მერყეობს -1.07-დან (BjGRF31) -0.45-მდე (BjGRF22), ყველა ჰიდროფილურ BjGRF ცილას აქვს უარყოფითი GRAVY მნიშვნელობები, რაც შეიძლება გამოწვეული იყოს ნარჩენებით გამოწვეული ჰიდროფობიურობის არარსებობით. უჯრედქვეშა ლოკალიზაციის პროგნოზმა აჩვენა, რომ 31 BjGRF კოდირებული ცილა შეიძლება ლოკალიზებული იყოს ბირთვში, BjGRF04 შეიძლება ლოკალიზებული იყოს პეროქსისომებში, BjGRF25 შეიძლება ლოკალიზებული იყოს ციტოპლაზმაში, ხოლო BjGRF28 შეიძლება ლოკალიზებული იყოს ქლოროპლასტებში (ცხრილი 1), რაც მიუთითებს, რომ BjGRF-ები შეიძლება ლოკალიზებული იყოს ბირთვში და მნიშვნელოვან მარეგულირებელ როლს ასრულებდეს ტრანსკრიფციის ფაქტორად.
სხვადასხვა სახეობაში GRF ოჯახების ფილოგენეტიკური ანალიზი ხელს უწყობს გენების ფუნქციების შესწავლას. ამრიგად, გადმოწერილი იქნა 35 რაფსის, 16 ტურნიპის, 12 ბრინჯის, 10 ფეტვის და 9 Arabidopsis GRF-ის სრული სიგრძის ამინომჟავების თანმიმდევრობები და ფილოგენეტიკური ხე შეიქმნა 34 იდენტიფიცირებული BjGRF გენის საფუძველზე (სურ. 1). სამი ქვეოჯახი შეიცავს წევრების სხვადასხვა რაოდენობას; 116 GRF TF იყოფა სამ სხვადასხვა ქვეოჯახად (ჯგუფები A~C), რომლებიც შეიცავენ GRF-ების 59 (50.86%), 34 (29.31%) და 23 (19.83)%-ს, შესაბამისად. მათ შორის, BjGRF ოჯახის 34 წევრი გაფანტულია 3 ქვეოჯახში: 13 წევრი A ჯგუფში (38.24%), 12 წევრი B ჯგუფში (35.29%) და 9 წევრი C ჯგუფში (26.47%). მდოგვის პოლიპლოიდიზაციის პროცესში, სხვადასხვა ქვეოჯახში BjGRFs გენების რაოდენობა განსხვავებულია და შესაძლოა, გენების ამპლიფიკაცია და დაკარგვა მომხდარიყო. აღსანიშნავია, რომ C ჯგუფში ბრინჯისა და ფეტვის GRF-ები არ არის განაწილებული, მაშინ როცა B ჯგუფში ბრინჯისა და ფეტვის GRF-ებია 2 და ფეტვის 1, ხოლო ბრინჯისა და ფეტვის GRF-ების უმეტესობა ერთ შტოშია დაჯგუფებული, რაც მიუთითებს, რომ BjGRF-ები მჭიდროდ ენათესავებიან დიკოტებს. მათ შორის, Arabidopsis thaliana-ში GRF ფუნქციის შესახებ ყველაზე სიღრმისეული კვლევები BjGRF-ების ფუნქციური კვლევების საფუძველს იძლევა.
მდოგვის ფილოგენეტიკური ხე, რომელიც მოიცავს Brassica napus-ს, Brassica napus-ს, ბრინჯს, ფეტვის და Arabidopsis thaliana GRF ოჯახის წევრებს.
მდოგვის GRF ოჯახში განმეორებადი გენების ანალიზი. ფონზე ნაცრისფერი ხაზი წარმოადგენს მდოგვის გენომის სინქრონიზებულ ბლოკს, წითელი ხაზი კი BjGRF გენის სეგმენტირებული განმეორებების წყვილს;
BjGRF გენის ექსპრესია გვალვის სტრესის ქვეშ მეოთხე ფოთლის სტადიაზე. qRT-PCR მონაცემები ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში S5. მონაცემებში მნიშვნელოვანი განსხვავებები მითითებულია პატარა ასოებით.
გლობალური კლიმატის ცვლილებასთან ერთად, კვლევის აქტუალური თემა გახდა იმის შესწავლა, თუ როგორ უმკლავდებიან კულტურები გვალვის სტრესს და აუმჯობესებენ მათ ტოლერანტობის მექანიზმებს18. გვალვის შემდეგ, მცენარეების მორფოლოგიური სტრუქტურა, გენების ექსპრესია და მეტაბოლური პროცესები შეიცვლება, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს ფოტოსინთეზის შეწყვეტა და მეტაბოლური დარღვევა, რაც გავლენას ახდენს კულტურების მოსავლიანობასა და ხარისხზე19,20,21. როდესაც მცენარეები გრძნობენ გვალვის სიგნალებს, ისინი გამოიმუშავებენ მეორეხარისხოვან მესენჯერებს, როგორიცაა Ca2+ და ფოსფატიდილინოზიტოლი, ზრდიან უჯრედშიდა კალციუმის იონების კონცენტრაციას და ააქტიურებენ ცილის ფოსფორილირების გზის მარეგულირებელ ქსელს22,23. საბოლოო სამიზნე ცილა პირდაპირ მონაწილეობს უჯრედულ დაცვაში ან არეგულირებს დაკავშირებული სტრესული გენების ექსპრესიას ტრანსკრიფტორების მეშვეობით, რაც ზრდის მცენარის ტოლერანტობას სტრესის მიმართ24,25. ამრიგად, ტრანსკრიფტორები გადამწყვეტ როლს ასრულებენ გვალვის სტრესზე რეაგირებაში. გვალვისადმი მგრძნობიარე ტრანსკრიფტორების თანმიმდევრობისა და დნმ-ის შეკავშირების თვისებების მიხედვით, ტრანსკრიფტორები შეიძლება დაიყოს სხვადასხვა ოჯახებად, როგორიცაა GRF, ERF, MYB, WRKY და სხვა ოჯახები26.
GRF გენების ოჯახი მცენარისთვის სპეციფიკური TF-ის ტიპია, რომელიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებს სხვადასხვა ასპექტში, როგორიცაა ზრდა, განვითარება, სიგნალის გადაცემა და მცენარის თავდაცვის რეაქციები27. მას შემდეგ, რაც პირველი GRF გენი იდენტიფიცირდა O. sativa-ში28, სულ უფრო მეტი GRF გენი იქნა იდენტიფიცირებული მრავალ სახეობაში და დადასტურდა, რომ ისინი გავლენას ახდენენ მცენარის ზრდაზე, განვითარებაზე და სტრესზე რეაქციაზე8, 29, 30,31,32. Brassica juncea-ს გენომის თანმიმდევრობის გამოქვეყნებით შესაძლებელი გახდა BjGRF გენების ოჯახის იდენტიფიცირება33. ამ კვლევაში, მდოგვის მთელ გენომში იდენტიფიცირებული იქნა 34 BjGRF გენი და მათი ქრომოსომული პოზიციის მიხედვით დასახელდა BjGRF01–BjGRF34. ყველა მათგანი შეიცავს მაღალკონსერვირებულ QLQ და WRC დომენებს. ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების ანალიზმა აჩვენა, რომ BjGRF ცილების ამინომჟავების რაოდენობასა და მოლეკულურ წონაში განსხვავებები (გარდა BjGRF28-ისა) არ იყო მნიშვნელოვანი, რაც მიუთითებს, რომ BjGRF ოჯახის წევრებს შეიძლება ჰქონდეთ მსგავსი ფუნქციები. გენის სტრუქტურის ანალიზმა აჩვენა, რომ BjGRF გენების 64.7% შეიცავდა 4 ეგზონს, რაც მიუთითებს, რომ BjGRF გენის სტრუქტურა ევოლუციის დროს შედარებით შენარჩუნებულია, მაგრამ BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 და BjGRF29 გენებში ეგზონების რაოდენობა უფრო დიდია. კვლევებმა აჩვენა, რომ ეგზონების ან ინტრონების დამატებამ ან წაშლამ შეიძლება გამოიწვიოს გენის სტრუქტურასა და ფუნქციაში განსხვავებები, რითაც წარმოიქმნება ახალი გენები34,35,36. ამიტომ, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ BjGRF-ის ინტრონი დაიკარგა ევოლუციის დროს, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს გენის ფუნქციის ცვლილებები. არსებული კვლევების შესაბამისად, ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ინტრონების რაოდენობა დაკავშირებული იყო გენის ექსპრესიასთან. როდესაც გენში ინტრონების რაოდენობა დიდია, გენს შეუძლია სწრაფად უპასუხოს სხვადასხვა არახელსაყრელ ფაქტორებს.
გენების დუბლირება გენომური და გენეტიკური ევოლუციის ერთ-ერთი მთავარი ფაქტორია37. დაკავშირებულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ გენების დუბლირება არა მხოლოდ ზრდის GRF გენების რაოდენობას, არამედ ახალი გენების გენერირების საშუალებასაც წარმოადგენს, რაც მცენარეებს სხვადასხვა არახელსაყრელ გარემო პირობებთან ადაპტაციაში ეხმარება38. ამ კვლევაში სულ 48 დუბლირებული გენის წყვილი იქნა აღმოჩენილი, რომელთაგან ყველა სეგმენტური დუბლირება იყო, რაც მიუთითებს, რომ სეგმენტური დუბლირება ამ ოჯახში გენების რაოდენობის გაზრდის მთავარი მექანიზმია. ლიტერატურაში აღნიშნულია, რომ სეგმენტურ დუბლირებას შეუძლია ეფექტურად შეუწყოს ხელი GRF გენების ოჯახის წევრების ამპლიფიკაციას Arabidopsis-სა და მარწყვში და ამ გენების ოჯახის ტანდემური დუბლირება არცერთ სახეობაში არ დაფიქსირებულა27,39. ამ კვლევის შედეგები შეესაბამება Arabidopsis thaliana-სა და მარწყვის ოჯახებზე არსებულ კვლევებს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ GRF ოჯახს შეუძლია გენების რაოდენობის გაზრდა და ახალი გენების გენერირება სხვადასხვა მცენარეში სეგმენტური დუბლირების გზით.
ამ კვლევაში, მდოგვში სულ 34 BjGRF გენი იქნა იდენტიფიცირებული, რომლებიც 3 ქვეოჯახად დაიყო. ამ გენებმა აჩვენეს მსგავსი კონსერვირებული მოტივები და გენის სტრუქტურები. კოლინეარობის ანალიზმა გამოავლინა სეგმენტების 48 წყვილი დუბლირება მდოგვში. BjGRF პრომოტერის რეგიონი შეიცავს ცის-მოქმედ ელემენტებს, რომლებიც დაკავშირებულია სინათლეზე რეაქციასთან, ჰორმონალურ რეაქციასთან, გარემო სტრესზე რეაქციასთან და ზრდა-განვითარებასთან. 34 BjGRF გენის ექსპრესია აღმოჩენილი იქნა მდოგვის ნერგის ეტაპზე (ფესვები, ღეროები, ფოთლები) და 10 BjGRF გენის ექსპრესიის ნიმუში გვალვის პირობებში. აღმოჩნდა, რომ BjGRF გენების ექსპრესიის ნიმუშები გვალვის სტრესის ქვეშ მსგავსი იყო და შესაძლოა მსგავსი იყოს. BjGRF03 და BjGRF32 გენებმა შეიძლება დადებითი მარეგულირებელი როლი შეასრულონ გვალვის სტრესში, ხოლო BjGRF06 და BjGRF23 როლს ასრულებენ გვალვის სტრესში, როგორც miR396 სამიზნე გენები. საერთო ჯამში, ჩვენი კვლევა ბიოლოგიურ საფუძველს იძლევა BjGRF გენის ფუნქციის სამომავლო აღმოჩენისთვის Brassicaceae მცენარეებში.
ამ ექსპერიმენტში გამოყენებული მდოგვის თესლი მოწოდებული იყო გუიჯოუს ზეთოვანი თესლის კვლევითი ინსტიტუტის, გუიჯოუს სოფლის მეურნეობის მეცნიერებათა აკადემიის მიერ. შეარჩიეთ მთლიანი თესლი და დარგეთ ნიადაგში (სუბსტრატი: ნიადაგი = 3:1), ხოლო ფესვები, ღეროები და ფოთლები შეაგროვეთ ოთხფოთლიანი სტადიის შემდეგ. მცენარეები დამუშავდა 20%-იანი PEG 6000-ით გვალვის სიმულირებისთვის, ხოლო ფოთლები შეგროვდა 0, 3, 6, 12 და 24 საათის შემდეგ. მცენარის ყველა ნიმუში დაუყოვნებლივ გაიყინა თხევად აზოტში და შემდეგ შეინახეს -80°C საყინულეში შემდეგი ტესტისთვის.
ამ კვლევის დროს მიღებული ან გაანალიზებული ყველა მონაცემი შედის გამოქვეყნებულ სტატიაში და დამატებით საინფორმაციო ფაილებში.