კომერციული ციპერმეტრინის პრეპარატების სიკვდილიანობა და ტოქსიკურობა მცირე წყლის თავკომბალებისთვის

ამ კვლევამ შეაფასა კომერციული პრეპარატების ლეტალურობა, სუბლეტალურობა და ტოქსიკურობა.ციპერმეტრინიანურანის თავკომბალების მიმართ ფორმულირებების გამოყენება. მწვავე ტესტში 96 საათის განმავლობაში შემოწმდა 100–800 მკგ/ლ კონცენტრაციები. ქრონიკულ ტესტში, სიკვდილიანობაზე შემოწმდა ციპერმეთრინის ბუნებრივად წარმოქმნილი კონცენტრაციები (1, 3, 6 და 20 მკგ/ლ), რასაც მოჰყვა მიკრობირთვული ტესტირება და ერითროციტების ბირთვის ანომალიები 7 დღის განმავლობაში. კომერციული ციპერმეთრინის ფორმულირების LC50 თავკომბალების მიმართ იყო 273.41 მკგ L−1. ქრონიკულ ტესტში ყველაზე მაღალმა კონცენტრაციამ (20 მკგ L−1) გამოიწვია 50%-ზე მეტი სიკვდილიანობა, რადგან მან გაანადგურა შემოწმებული თავკომბალების ნახევარი. მიკრობირთვულმა ტესტმა აჩვენა მნიშვნელოვანი შედეგები 6 და 20 მკგ L−1-ზე და აღმოჩენილი იქნა რამდენიმე ბირთვული ანომალია, რაც მიუთითებს, რომ კომერციულ ციპერმეთრინის ფორმულირებას აქვს გენოტოქსიკური პოტენციალი P. gracilis-ის წინააღმდეგ. ციპერმეთრინი ამ სახეობისთვის მაღალი რისკის შემცველია, რაც მიუთითებს, რომ მას შეუძლია მრავალი პრობლემის გამოწვევა და ამ ეკოსისტემის დინამიკაზე მოკლევადიან და გრძელვადიან პერსპექტივაში გავლენის მოხდენა. შესაბამისად, შეიძლება დავასკვნათ, რომ კომერციულ ციპერმეთრინის ფორმულირებებს ტოქსიკური გავლენა აქვთ P. gracilis-ზე.
სასოფლო-სამეურნეო საქმიანობის უწყვეტი გაფართოებისა და ინტენსიური გამოყენების გამომავნებლების კონტროლიზომების მიღების შემდეგ, წყლის ცხოველები ხშირად ექვემდებარებიან პესტიციდების ზემოქმედებას1,2. სასოფლო-სამეურნეო მიწებთან ახლოს წყლის რესურსების დაბინძურებამ შეიძლება გავლენა მოახდინოს ისეთი არასამიზნე ორგანიზმების, როგორიცაა ამფიბიები, განვითარებასა და გადარჩენაზე.
ამფიბიები სულ უფრო მნიშვნელოვანი ხდებიან გარემოსდაცვითი მატრიცების შეფასებისას. ანურანები გარემოს დამაბინძურებლების კარგ ბიოინდიკატორებად ითვლებიან მათი უნიკალური მახასიათებლების გამო, როგორიცაა რთული სასიცოცხლო ციკლები, ლარვების სწრაფი ზრდის ტემპი, ტროფიკული სტატუსი, გამტარი კანი10,11, წყალზე დამოკიდებულება გამრავლებისთვის12 და დაუცველი კვერცხები11,13,14. პატარა წყლის ბაყაყი (Physalaemus gracilis), რომელიც ფართოდ არის ცნობილი როგორც მტირალა ბაყაყი, პესტიციდებით დაბინძურების ბიოინდიკატორ სახეობად იქნა მიჩნეული4,5,6,7,15. ეს სახეობა გვხვდება არგენტინაში, ურუგვაიში, პარაგვაიში და ბრაზილიაში1617 მდგარ წყლებში, დაცულ ტერიტორიებზე ან ცვალებადი ჰაბიტატის მქონე ტერიტორიებზე და IUCN კლასიფიკაციით სტაბილურად ითვლება მისი ფართო გავრცელებისა და სხვადასხვა ჰაბიტატისადმი ტოლერანტობის გამო18.
ციპერმეთრინის ზემოქმედების შემდეგ ამფიბიებში სუბლეტალური ეფექტები დაფიქსირდა, მათ შორის თავკომბალების ქცევითი, მორფოლოგიური და ბიოქიმიური ცვლილებები23,24,25, სიკვდილიანობისა და მეტამორფოზის დროის ცვლილება, ფერმენტული ცვლილებები, გამოჩეკვის წარმატების შემცირება24,25, ჰიპერაქტიურობა26, ქოლინესტერაზას აქტივობის ინჰიბირება27 და ცურვის უნარის ცვლილებები7,28. თუმცა, ამფიბიებში ციპერმეთრინის გენოტოქსიური ეფექტების კვლევები შეზღუდულია. ამიტომ, მნიშვნელოვანია შეფასდეს ანურანის სახეობების მგრძნობელობა ციპერმეთრინის მიმართ.
გარემოს დაბინძურება გავლენას ახდენს ამფიბიების ნორმალურ ზრდა-განვითარებაზე, მაგრამ ყველაზე სერიოზული უარყოფითი ეფექტია დნმ-ის გენეტიკური დაზიანება, რომელიც გამოწვეულია პესტიციდების ზემოქმედებით13. სისხლის უჯრედების მორფოლოგიის ანალიზი დაბინძურების და ველური სახეობებისთვის ნივთიერების პოტენციური ტოქსიკურობის მნიშვნელოვანი ბიოინდიკატორია29. მიკრობირთვული ტესტი გარემოში ქიმიკატების გენოტოქსიკურობის დასადგენად ერთ-ერთი ყველაზე ხშირად გამოყენებული მეთოდია30. ეს არის სწრაფი, ეფექტური და იაფი მეთოდი, რომელიც წარმოადგენს ისეთი ორგანიზმების ქიმიური დაბინძურების კარგ ინდიკატორს, როგორიცაა ამფიბიები31,32 და შეუძლია მოგაწოდოთ ინფორმაცია გენოტოქსიკური დამაბინძურებლების ზემოქმედების შესახებ33.
ამ კვლევის მიზანი იყო კომერციული ციპერმეტრინის ფორმულირებების ტოქსიკური პოტენციალის შეფასება მცირე წყლის თავკომბალებისთვის მიკრობირთვული ტესტისა და ეკოლოგიური რისკის შეფასების გამოყენებით.
ტესტის მწვავე პერიოდში კომერციული ციპერმეტრინის სხვადასხვა კონცენტრაციის ზემოქმედების ქვეშ მყოფი P. gracilis-ის თავკომბალების კუმულაციური სიკვდილიანობა (%).
ქრონიკული ტესტის დროს კომერციული ციპერმეთრინის სხვადასხვა კონცენტრაციის ზემოქმედების ქვეშ მყოფი P. gracilis-ის თავკომბალების კუმულაციური სიკვდილიანობა (%).
დაფიქსირებული მაღალი სიკვდილიანობა გამოწვეული იყო ციპერმეტრინის სხვადასხვა კონცენტრაციის (6 და 20 მკგ/ლ) ზემოქმედების ქვეშ მყოფ ამფიბიებში გენოტოქსიკური ეფექტებით, რასაც ადასტურებს მიკრობირთვების (MN) არსებობა და ერითროციტებში ბირთვული ანომალიები. MN-ის წარმოქმნა მიუთითებს მიტოზის შეცდომებზე და ასოცირდება ქრომოსომების მიკროტუბულებთან ცუდ შეკავშირებასთან, ქრომოსომების შთანთქმისა და ტრანსპორტირებისთვის პასუხისმგებელ ცილოვან კომპლექსებში დეფექტებთან, ქრომოსომების სეგრეგაციის შეცდომებთან და დნმ-ის დაზიანების აღდგენის შეცდომებთან38,39 და შეიძლება დაკავშირებული იყოს პესტიციდებით გამოწვეულ ჟანგვით სტრესთან40,41. სხვა ანომალიები დაფიქსირდა ყველა შეფასებული კონცენტრაციის დროს. ციპერმეტრინის კონცენტრაციის ზრდამ ერითროციტებში ბირთვული ანომალიები გაზარდა 5%-ით და 20%-ით, შესაბამისად, ყველაზე დაბალი (1 მკგ/ლ) და ყველაზე მაღალი (20 მკგ/ლ) დოზების დროს. მაგალითად, სახეობის დნმ-ში ცვლილებებს შეიძლება ჰქონდეს სერიოზული შედეგები როგორც მოკლევადიანი, ასევე გრძელვადიანი გადარჩენისთვის, რაც იწვევს პოპულაციის შემცირებას, რეპროდუქციული ვარგისიანობის შეცვლას, ინბრიდინგს, გენეტიკური მრავალფეროვნების დაკარგვას და მიგრაციის სიჩქარის ცვლილებას. ყველა ამ ფაქტორს შეუძლია გავლენა მოახდინოს სახეობის გადარჩენასა და შენარჩუნებაზე42,43. ერითროიდული ანომალიების წარმოქმნა შეიძლება მიუთითებდეს ციტოკინეზის ბლოკადაზე, რაც იწვევს უჯრედების დაყოფას (ორბირთვიანი ერითროციტები)44,45; მრავალწილაკიანი ბირთვები ბირთვის მემბრანის გამონაზარდებია მრავლობითი წილებით46, ხოლო სხვა ერითროიდული ანომალიები შეიძლება დაკავშირებული იყოს დნმ-ის ამპლიფიკაციასთან, როგორიცაა ბირთვული თირკმელები/ბუშტები47. ბირთვიანი ერითროციტების არსებობა შეიძლება მიუთითებდეს ჟანგბადის ტრანსპორტირების დარღვევაზე, განსაკუთრებით დაბინძურებულ წყალში48,49. აპოპტოზი მიუთითებს უჯრედების სიკვდილზე50.
სხვა კვლევებმა ასევე აჩვენა ციპერმეთრინის გენოტოქსიკური ეფექტები. კაბანია და სხვ.51 აჩვენეს მიკრობირთვებისა და ბირთვული ცვლილებების არსებობა, როგორიცაა ორბირთვიანი უჯრედები და აპოპტოზური უჯრედები Odontophrynus americanus-ის უჯრედებში ციპერმეთრინის მაღალი კონცენტრაციის (5000 და 10,000 μg L−1) 96 საათის განმავლობაში ზემოქმედების შემდეგ. ციპერმეთრინით გამოწვეული აპოპტოზი ასევე დაფიქსირდა P. biligonigerus52 და Rhinella arenarum53-ში. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ციპერმეთრინს აქვს გენოტოქსიკური ეფექტები წყლის ორგანიზმების ფართო სპექტრზე და რომ MN და ENA ანალიზი შეიძლება იყოს ამფიბიებზე სუბლეტალური ეფექტების ინდიკატორი და შეიძლება გამოყენებულ იქნას ტოქსიკანტების ზემოქმედების ქვეშ მყოფი ადგილობრივი სახეობებისა და ველური პოპულაციებისთვის12.
ციპერმეტრინის კომერციული ფორმულირებები მაღალ გარემოსდაცვით საფრთხეს წარმოადგენს (როგორც მწვავე, ასევე ქრონიკული), სადაც HQ-ის შემცველობა აღემატება აშშ-ის გარემოს დაცვის სააგენტოს (EPA) მიერ დადგენილ დონეს54, რამაც შეიძლება უარყოფითად იმოქმედოს სახეობაზე, თუ გარემოში იქნება. ქრონიკული რისკის შეფასებისას, სიკვდილიანობის NOEC იყო 3 μg L−1, რაც ადასტურებს, რომ წყალში აღმოჩენილი კონცენტრაციები შეიძლება საფრთხეს უქმნიდეს სახეობას55. ენდოსულფანისა და ციპერმეტრინის ნარევის ზემოქმედების ქვეშ მყოფი R. arenarum-ის ლარვებისთვის ლეტალური NOEC იყო 500 μg L−1 168 საათის შემდეგ; ეს მნიშვნელობა შემცირდა 0.0005 μg L−1-მდე 336 საათის შემდეგ. ავტორები აჩვენებენ, რომ რაც უფრო ხანგრძლივია ზემოქმედება, მით უფრო დაბალია სახეობისთვის საზიანო კონცენტრაციები. ასევე მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ NOEC-ის მნიშვნელობები უფრო მაღალი იყო, ვიდრე P. gracilis-ის მაჩვენებლები იმავე ზემოქმედების დროს, რაც მიუთითებს, რომ სახეობის რეაქცია ციპერმეთრინზე სახეობის სპეციფიკურია. გარდა ამისა, სიკვდილიანობის თვალსაზრისით, ციპერმეტრინის ზემოქმედების შემდეგ P. gracilis-ის CHQ მნიშვნელობამ 64.67-ს მიაღწია, რაც უფრო მაღალია, ვიდრე აშშ-ის გარემოს დაცვის სააგენტოს მიერ დადგენილი საცნობარო მნიშვნელობა54, ხოლო R. arenarum-ის ლარვების CHQ მნიშვნელობა ასევე უფრო მაღალი იყო, ვიდრე ეს მნიშვნელობა (CHQ > 388.00 336 საათის შემდეგ), რაც მიუთითებს, რომ შესწავლილი ინსექტიციდები მაღალ რისკს წარმოადგენენ ამფიბიების რამდენიმე სახეობისთვის. იმის გათვალისწინებით, რომ P. gracilis-ს მეტამორფოზის დასასრულებლად დაახლოებით 30 დღე სჭირდება56, შეიძლება დავასკვნათ, რომ ციპერმეტრინის შესწავლილმა კონცენტრაციებმა შეიძლება ხელი შეუწყოს პოპულაციის შემცირებას ინფიცირებული ინდივიდების ადრეულ ასაკში ზრდასრულ ან რეპროდუქციულ სტადიაზე გადასვლის თავიდან აცილებით.
მიკრობირთვებისა და ერითროციტების ბირთვული სხვა ანომალიების გამოთვლილი რისკის შეფასებისას, CHQ მნიშვნელობები მერყეობდა 14.92-დან 97.00-მდე, რაც მიუთითებს, რომ ციპერმეთრინს ჰქონდა პოტენციური გენოტოქსიკური რისკი P. gracilis-ისთვის მის ბუნებრივ ჰაბიტატშიც კი. სიკვდილიანობის გათვალისწინებით, ქსენობიოტიკური ნაერთების მაქსიმალური კონცენტრაცია, რომელიც ასატანია P. gracilis-ისთვის, იყო 4.24 μg L−1. თუმცა, 1 μg/L-მდე დაბალმა კონცენტრაციებმაც აჩვენა გენოტოქსიკური ეფექტები. ამ ფაქტმა შეიძლება გამოიწვიოს პათოლოგიური ინდივიდების რაოდენობის ზრდა57 და გავლენა მოახდინოს სახეობების განვითარებასა და რეპროდუქციაზე მათ ჰაბიტატებში, რაც იწვევს ამფიბიების პოპულაციების შემცირებას.
ინსექტიციდ ციპერმეთრინის კომერციულმა ფორმულირებებმა P. gracilis-ის მიმართ მაღალი მწვავე და ქრონიკული ტოქსიკურობა გამოავლინა. დაფიქსირდა სიკვდილიანობის უფრო მაღალი მაჩვენებლები, სავარაუდოდ, ტოქსიკური ეფექტების გამო, რასაც ადასტურებს მიკრობირთვებისა და ერითროციტების ბირთვული ანომალიების არსებობა, განსაკუთრებით დაკბილული ბირთვების, წილებიანი ბირთვების და ვეზიკულური ბირთვების. გარდა ამისა, შესწავლილ სახეობებს აღენიშნებოდათ გაზრდილი გარემო რისკები, როგორც მწვავე, ასევე ქრონიკული. ამ მონაცემებმა, ჩვენი კვლევითი ჯგუფის მიერ ჩატარებულ წინა კვლევებთან ერთად, აჩვენა, რომ ციპერმეთრინის სხვადასხვა კომერციული ფორმულირებებიც კი იწვევდა აცეტილქოლინესტერაზას (AChE) და ბუტირილქოლინესტერაზას (BChE) აქტივობის შემცირებას და ჟანგვით სტრესს58, და იწვევდა ცურვის აქტივობის ცვლილებებს და პირის ღრუს მალფორმაციებს59, რაც მიუთითებს, რომ ციპერმეთრინის კომერციულ ფორმულირებებს ამ სახეობისთვის მაღალი ლეტალური და სუბლეტალური ტოქსიკურობა აქვთ. ჰარტმანმა და სხვებმა60 აღმოაჩინეს, რომ ციპერმეთრინის კომერციული ფორმულირებები ყველაზე ტოქსიკური იყო P. gracilis-ისა და იმავე გვარის სხვა სახეობისთვის (P. cuvieri) ცხრა სხვა პესტიციდთან შედარებით. ეს იმაზე მიუთითებს, რომ გარემოს დაცვის მიზნით ციპერმეთრინის კანონიერად დამტკიცებულმა კონცენტრაციებმა შეიძლება გამოიწვიოს მაღალი სიკვდილიანობა და პოპულაციის ხანგრძლივი შემცირება.
ამფიბიებისთვის პესტიციდის ტოქსიკურობის შესაფასებლად საჭიროა შემდგომი კვლევები, რადგან გარემოში აღმოჩენილმა კონცენტრაციებმა შეიძლება გამოიწვიოს მაღალი სიკვდილიანობა და პოტენციური რისკი შექმნას P. gracilis-ისთვის. ამფიბიების სახეობებზე კვლევის ჩატარება უნდა წახალისდეს, რადგან ამ ორგანიზმების შესახებ მონაცემები მწირია, განსაკუთრებით ბრაზილიურ სახეობებზე.
ქრონიკული ტოქსიკურობის ტესტი სტატიკურ პირობებში 168 საათის განმავლობაში (7 დღე) მიმდინარეობდა და სუბლეტალური კონცენტრაციები იყო: 1, 3, 6 და 20 მკგ ai L−1. ორივე ექსპერიმენტში, დამუშავების ჯგუფში 10 თავკომბალა შეფასდა ექვსი გამეორებით, სულ 60 თავკომბალა თითო კონცენტრაციაზე. ამასობაში, მხოლოდ წყლით დამუშავება უარყოფითი კონტროლის ფუნქციას ასრულებდა. თითოეული ექსპერიმენტული მოწყობილობა შედგებოდა სტერილური შუშის ჭურჭლისგან, რომლის ტევადობა იყო 500 მლ და სიმკვრივე იყო 1 თავკომბალა ხსნარში 50 მლ. კოლბა დაფარული იყო პოლიეთილენის აპკით აორთქლების თავიდან ასაცილებლად და მუდმივად აერირებული იყო.
წყალი ქიმიურად გაანალიზდა პესტიციდების კონცენტრაციის დასადგენად 0, 96 და 168 საათში. საბინის და სხვ. 68 და მარტინსის და სხვ. 69 თანახმად, ანალიზები ჩატარდა სანტა მარიას ფედერალური უნივერსიტეტის პესტიციდების ანალიზის ლაბორატორიაში (LARP) სამმაგი კვადრუპოლური მას-სპექტრომეტრიასთან შერწყმული გაზის ქრომატოგრაფიის გამოყენებით (Varian მოდელი 1200, პალო ალტო, კალიფორნია, აშშ). წყალში პესტიციდების რაოდენობრივი განსაზღვრა ნაჩვენებია დამატებით მასალად (ცხრილი SM1).
მიკრობირთვული ტესტის (MNT) და ერითროციტების ბირთვული ანომალიის ტესტის (RNA) ჩასატარებლად, თითოეული სამკურნალო ჯგუფიდან გაანალიზდა 15 თავკომბალა. თავკომბალებს ანესთეზია ჩაუტარდათ 5%-იანი ლიდოკაინით (50 მგ გ-170) და სისხლის ნიმუშები აღებული იქნა გულის პუნქციით ერთჯერადი ჰეპარინიზებული შპრიცების გამოყენებით. სისხლის ნაცხი მომზადდა სტერილურ მიკროსკოპის სლაიდებზე, გაშრა ჰაერზე, ფიქსირდა 100%-იანი მეთანოლით (4 °C) 2 წუთის განმავლობაში და შემდეგ შეიღება 10%-იანი გიემზას ხსნარით 15 წუთის განმავლობაში სიბნელეში. პროცესის დასასრულს, სლაიდები გაირეცხა გამოხდილი წყლით ზედმეტი საღებავის მოსაშორებლად და გაშრა ოთახის ტემპერატურაზე.
თითოეული თავკომბალას სულ მცირე 1000 ერითროციტი გაანალიზდა 100× მიკროსკოპის გამოყენებით 71 ობიექტივით, რათა დადგინდეს MN-ის და ENA-ს არსებობა. შეფასდა თავკომბალას 75,796 ერითროციტი ციპერმეტრინის კონცენტრაციებისა და კონტროლის გათვალისწინებით. გენოტოქსიკურობა გაანალიზდა კარასკოს და სხვ. და ფენეჩის და სხვ. მეთოდის მიხედვით38,72, შემდეგი ბირთვული დაზიანებების სიხშირის განსაზღვრით: (1) ანურკომილური უჯრედები: უჯრედები ბირთვის გარეშე; (2) აპოპტოზური უჯრედები: ბირთვის ფრაგმენტაცია, დაპროგრამებული უჯრედის სიკვდილი; (3) ორბირთვიანი უჯრედები: უჯრედები ორი ბირთვით; (4) ბირთვული კვირტები ან ბუშტუკოვანი უჯრედები: უჯრედები ბირთვის მემბრანის მცირე გამონაზარდებით, ბუშტუკები ზომით მიკრობირთვების მსგავსი; (5) კარიოლიზირებული უჯრედები: უჯრედები მხოლოდ ბირთვის კონტურით შიდა მასალის გარეშე; (6) დაკბილული უჯრედები: უჯრედები ბირთვის ფორმით აშკარა ბზარებით ან დაკბილულებით, რომლებსაც ასევე თირკმლის ფორმის ბირთვებს უწოდებენ; (7) ლობულირებული უჯრედები: უჯრედები ბირთვული გამონაზარდებით, რომლებიც ზემოხსენებულ ვეზიკულებზე დიდია; და (8) მიკროუჯრედები: უჯრედები შედედებული ბირთვებით და შემცირებული ციტოპლაზმით. ცვლილებები შედარებული იქნა უარყოფითი კონტროლის შედეგებთან.
მწვავე ტოქსიკურობის ტესტის შედეგები (LC50) გაანალიზდა GBasic პროგრამული უზრუნველყოფისა და TSK-Trimmed Spearman-Karber მეთოდის74 გამოყენებით. ქრონიკული ტესტის მონაცემები წინასწარ შემოწმდა შეცდომის ნორმალურობაზე (შაპირო-ვილკსი) და ვარიაციის ერთგვაროვნებაზე (ბარტლეტი). შედეგები გაანალიზდა ვარიაციის ცალმხრივი ანალიზის (ANOVA) გამოყენებით. ტუკის ტესტი გამოყენებული იქნა მონაცემების ერთმანეთთან შესადარებლად, ხოლო დანეტის ტესტი - მკურნალობის ჯგუფსა და უარყოფით საკონტროლო ჯგუფს შორის მონაცემების შესადარებლად.
LOEC და NOEC მონაცემები გაანალიზდა დანეტის ტესტის გამოყენებით. სტატისტიკური ტესტები ჩატარდა Statistica 8.0 პროგრამული უზრუნველყოფის (StatSoft) გამოყენებით 95% მნიშვნელოვნების დონით (p < 0.05).