რაოდენობრივი გიბერელინის ბიოსენსორი ავლენს გიბერელინების როლს ინტერნოდის სპეციფიკაციაში გასროლის აპიკალურ მერისტემაში

ყლორტების აპიკალური მერისტემის (SAM) ზრდა გადამწყვეტია ღეროს არქიტექტურისთვის. მცენარეული ჰორმონებიგიბერელინები(GAs) თამაშობენ მთავარ როლს მცენარის ზრდის კოორდინაციაში, მაგრამ მათი როლი SAM-ში ჯერ კიდევ ცუდად არის გასაგები. აქ ჩვენ შევიმუშავეთ GA სიგნალის რაციონალური ბიოსენსორი DELLA პროტეინის ინჟინერიით, რათა დათრგუნოს მისი არსებითი მარეგულირებელი ფუნქცია GA ტრანსკრიპციულ პასუხში და შენარჩუნდეს მისი დეგრადაცია GA ამოცნობისას. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ეს დეგრადაციაზე დაფუძნებული ბიოსენსორი ზუსტად აღრიცხავს ცვლილებებს GA დონეზე და უჯრედულ ზონდირებაში განვითარების დროს. ჩვენ გამოვიყენეთ ეს ბიოსენსორი SAM-ში GA სიგნალიზაციის აქტივობის გამოსასახად. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ მაღალი GA სიგნალები წარმოდგენილია ძირითადად უჯრედებში, რომლებიც განლაგებულია ორგანოთა პრიმორდიებს შორის, რომლებიც არიან კვანძთაშორისი უჯრედების წინამორბედები. ფუნქციის მომატებისა და დაკარგვის მიდგომების გამოყენებით, ჩვენ კიდევ ვაჩვენებთ, რომ GA არეგულირებს უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციას, ადგენს ინტერკვანძების კანონიკურ ფიჭურ ორგანიზაციას, რითაც ხელს უწყობს ინტერკვანძების სპეციფიკაციას SAM-ში.
ყლორტის აპიკალური მერისტემა (SAM), რომელიც მდებარეობს ყლორტების მწვერვალზე, შეიცავს ღეროვანი უჯრედების ნიშას, რომელთა აქტივობა წარმოქმნის გვერდითი ორგანოებისა და ღეროვანი კვანძების მოდულურ და განმეორებით მცენარის სიცოცხლის განმავლობაში. თითოეული ეს განმეორებადი ერთეული, ანუ მცენარის კვანძი, მოიცავს კვანძთაშუა და გვერდითი ორგანოებს კვანძებში და იღლიის მერისტემებს ფოთლის იღლიებში1. მცენარის კვანძების ზრდა და ორგანიზაცია იცვლება განვითარების პროცესში. Arabidopsis-ში კვანძთაშორისი ზრდა თრგუნავს ვეგეტატიურ სტადიაზე და იღლიის მერისტემები მიძინებული რჩება როზეტის ფოთლების იღლიებში. ყვავილოვან ფაზაზე გადასვლისას SAM იქცევა ყვავილის მერისტემად, წარმოქმნის წაგრძელებულ კვანძებს და იღლიის კვირტებს, ტოტებს კაულინის ფოთლების იღლიებში და მოგვიანებით უფოთლო ყვავილებს2. მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ მივაღწიეთ მნიშვნელოვან პროგრესს იმ მექანიზმების გაგებაში, რომლებიც აკონტროლებენ ფოთლების, ყვავილების და ტოტების დაწყებას, შედარებით ცოტაა ცნობილი იმის შესახებ, თუ როგორ წარმოიქმნება კვანძები.
გაზების სივრცითი-დროებითი განაწილების გაგება ხელს შეუწყობს ამ ჰორმონების ფუნქციების უკეთ გააზრებას სხვადასხვა ქსოვილებში და განვითარების სხვადასხვა ეტაპზე. საკუთარი პრომოტორის მოქმედებით გამოხატული RGA-GFP შერწყმის დეგრადაციის ვიზუალიზაცია იძლევა მნიშვნელოვან ინფორმაციას ფესვებში მთლიანი GA დონის რეგულირების შესახებ15,16. თუმცა, RGA გამოხატულება განსხვავდება ქსოვილებში17 და რეგულირდება GA18-ით. ამრიგად, RGA პრომოტორის დიფერენციალურმა გამოხატვამ შეიძლება გამოიწვიოს ფლუორესცენციის ნიმუში, რომელიც შეინიშნება RGA-GFP-ით და, შესაბამისად, ეს მეთოდი არ არის რაოდენობრივი. სულ ახლახან, ბიოაქტიური ფლუორესცეინის (Fl) მარკირებული GA19,20 გამოავლინა GA-ს დაგროვება ფესვის ენდოკორტექსში და მისი უჯრედული დონის რეგულირება GA ტრანსპორტით. ცოტა ხნის წინ, GA FRET სენსორმა nlsGPS1 აჩვენა, რომ GA დონეები კორელაციაშია უჯრედების გახანგრძლივებასთან ფესვებში, ძაფებში და მუქად გაზრდილ ჰიპოკოტილებს21. თუმცა, როგორც ვნახეთ, GA კონცენტრაცია არ არის ერთადერთი პარამეტრი, რომელიც აკონტროლებს GA სიგნალის აქტივობას, რადგან ეს დამოკიდებულია კომპლექსურ სენსორულ პროცესებზე. აქ, DELLA და GA სასიგნალო გზების შესახებ ჩვენს ცოდნაზე დაყრდნობით, ჩვენ ვახსენებთ GA სიგნალის დეგრადაციაზე დაფუძნებული რაციომეტრული ბიოსენსორის შემუშავებას და დახასიათებას. ამ რაოდენობრივი ბიოსენსორის შესაქმნელად, ჩვენ გამოვიყენეთ მუტანტი GA-მგრძნობიარე RGA, რომელიც შერწყმულია ფლუორესცენტურ ცილასთან და ყველგან გამოხატული ქსოვილებში, ისევე როგორც GA-მგრძნობიარე ფლუორესცენტური ცილა. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ მუტანტური RGA პროტეინის შერწყმა არ უშლის ხელს ენდოგენურ GA სიგნალიზაციას, როდესაც ყველგან არის გამოხატული, და რომ ამ ბიოსენსორს შეუძლია რაოდენობრივად განსაზღვროს სასიგნალო აქტივობა როგორც GA შეყვანის, ასევე GA სიგნალის დამუშავების შედეგად სენსორული აპარატის მაღალი სივრცითი-დროებითი გარჩევადობით. ჩვენ გამოვიყენეთ ეს ბიოსენსორი GA სასიგნალო აქტივობის სივრცითი-დროებითი განაწილების გამოსასახად და რაოდენობრივად როგორ არეგულირებს GA უჯრედულ ქცევას SAM ეპიდერმისში. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ GA არეგულირებს SAM უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციას, რომელიც მდებარეობს ორგანოს პრიმორდიებს შორის, რითაც განსაზღვრავს ინტერნოდის კანონიკურ ფიჭურ ორგანიზაციას.
საბოლოოდ, ჩვენ ვკითხეთ, შეეძლო თუ არა qmRGA-ს მოხსენება ენდოგენური GA დონის ცვლილებების შესახებ მზარდი ჰიპოკოტილების გამოყენებით. ჩვენ ადრე ვაჩვენეთ, რომ ნიტრატი ასტიმულირებს ზრდას GA სინთეზის გაზრდით და, თავის მხრივ, DELLA34 დეგრადაციის გაზრდით. შესაბამისად, ჩვენ დავაკვირდით, რომ ჰიპოკოტილის სიგრძე pUBQ10::qmRGA ნერგებში, რომლებიც გაიზარდა ნიტრატების უხვი მარაგის პირობებში (10 მმ NO3−) მნიშვნელოვნად აღემატებოდა ნიტრატების დეფიციტის პირობებში გაზრდილ ნერგებში (დამატებითი სურ. 6a). ზრდის პასუხის შესაბამისად, GA სიგნალები უფრო მაღალი იყო ნერგების ჰიპოკოტილებში, რომლებიც გაიზარდა 10 მმ NO3− პირობებში, ვიდრე ნიტრატის არარსებობის პირობებში გაზრდილ ნერგებში (დამატებითი სურ. 6b, c). ამრიგად, qmRGA ასევე იძლევა GA სიგნალის ცვლილებების მონიტორინგს, რომელიც გამოწვეულია GA კონცენტრაციის ენდოგენური ცვლილებებით.
იმის გასაგებად, დამოკიდებულია თუ არა qmRGA-ს მიერ გამოვლენილი GA სიგნალის აქტივობა GA კონცენტრაციაზე და GA აღქმაზე, როგორც მოსალოდნელი იყო სენსორის დიზაინის საფუძველზე, ჩვენ გავაანალიზეთ სამი GID1 რეცეპტორის გამოხატულება ვეგეტატიურ და რეპროდუქციულ ქსოვილებში. ნერგებში, GID1-GUS რეპორტიორის ხაზმა აჩვენა, რომ GID1a და c ძალიან გამოხატული იყო კოტილედონებში (ნახ. 3a–c). გარდა ამისა, სამივე რეცეპტორი გამოხატული იყო ფოთლებში, გვერდითი ფესვის პრიმორდიაში, ფესვის წვერებში (გარდა GID1b-ის ფესვის ქუდისა) და სისხლძარღვთა სისტემაში (ნახ. 3a–c). ყვავილობის SAM-ში ჩვენ აღმოვაჩინეთ GUS სიგნალები მხოლოდ GID1b და 1c (დამატებითი სურ. 7a–c). In situ ჰიბრიდიზაციამ დაადასტურა გამოხატვის ეს შაბლონები და შემდგომში აჩვენა, რომ GID1c იყო ერთნაირად გამოხატული დაბალ დონეზე SAM-ში, მაშინ როცა GID1b აჩვენებდა უფრო მაღალ გამოხატულებას SAM-ის პერიფერიაზე (დამატებითი სურ. 7d-l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ტრანსლაციურმა შერწყმა ასევე გამოავლინა GID1b გამოხატვის ფასდაკლებული დიაპაზონი, დაბალი ან საერთოდ არ გამოხატვისგან SAM-ის ცენტრში მაღალ ექსპრესიამდე ორგანოს საზღვრებზე (დამატებითი სურ. 7მ). ამრიგად, GID1 რეცეპტორები არ არის ერთნაირად განაწილებული ქსოვილებში და შიგნით. შემდგომ ექსპერიმენტებში ჩვენ ასევე დავაფიქსირეთ, რომ GID1-ის ზედმეტად გამოხატვამ (pUBQ10::GID1a-mCherry) გაზარდა qmRGA-ს მგრძნობელობა ჰიპოკოტილში GA გარე გამოყენების მიმართ (ნახ. 3d, e). ამის საპირისპიროდ, ჰიპოკოტილში qd17mRGA გაზომილი ფლუორესცენცია არ იყო მგრძნობიარე GA3 მკურნალობის მიმართ (ნახ. 3f, g). ორივე ანალიზისთვის, ნერგები დამუშავდა GA-ს მაღალი კონცენტრაციით (100 μM GA3) სენსორის სწრაფი ქცევის შესაფასებლად, სადაც გაძლიერებული ან დაკარგული იყო GID1 რეცეპტორთან შეკავშირების უნარი. ეს შედეგები ერთად ადასტურებს, რომ qmRGA ბიოსენსორი ასრულებს GA და GA სენსორის კომბინირებულ ფუნქციას და ვარაუდობს, რომ GID1 რეცეპტორის დიფერენციალურ გამოხატულებას შეუძლია მნიშვნელოვნად მოახდინოს სენსორის ემისიურობის მოდულირება.
დღემდე, GA სიგნალების განაწილება SAM-ში გაურკვეველი რჩება. ამიტომ, ჩვენ გამოვიყენეთ qmRGA-გამომსახველი მცენარეები და pCLV3::mCherry-NLS ღეროვანი უჯრედის მომხსენებელი35 GA სასიგნალო აქტივობის მაღალი გარჩევადობის რაოდენობრივი რუქების გამოსათვლელად, ფოკუსირებული L1 ფენაზე (ეპიდერმისი; ნახ. 4a, b, იხილეთ მეთოდები და დამატებითი მეთოდები SAM ზრდის როლს a31-ში). აქ, pCLV3::mCherry-NLS გამოხატულება უზრუნველყოფდა ფიქსირებულ გეომეტრიულ საცნობარო წერტილს GA სასიგნალო აქტივობის სივრცითი დროითი განაწილების გასაანალიზებლად37. მიუხედავად იმისა, რომ GA არსებითად ითვლება გვერდითი ორგანოს განვითარებისთვის4, ჩვენ დავინახეთ, რომ GA სიგნალები დაბალი იყო ყვავილოვან პრიმოდიუმში (P) დაწყებული P3 სტადიიდან (ნახ. 4a, b), ხოლო ახალგაზრდა P1 და P2 პრიმოდიუმებს ჰქონდათ ზომიერი აქტივობა, როგორც ცენტრალურ რეგიონში (ნახ. 4a, b). უფრო მაღალი GA სასიგნალო აქტივობა გამოვლინდა ორგანოს პრიმოდიუმის საზღვრებზე, დაწყებული P1/P2-დან (საზღვრის გვერდებზე) და პიკს აღწევს P4-ზე, ისევე როგორც პრიმოდიას შორის მდებარე პერიფერიული რეგიონის ყველა უჯრედში (ნახ. 4a, b და დამატებითი ნახ. 8a, b). ეს უმაღლესი GA სასიგნალო აქტივობა დაფიქსირდა არა მხოლოდ ეპიდერმისში, არამედ L2 და ზედა L3 ფენებში (დამატებითი სურ. 8b). SAM-ში qmRGA-ს გამოყენებით აღმოჩენილი GA სიგნალების ნიმუში ასევე უცვლელი დარჩა დროთა განმავლობაში (დამატებითი სურ. 8c–f, k). მიუხედავად იმისა, რომ qd17mRGA კონსტრუქცია სისტემატურად იყო დაქვეითებული T3 მცენარეების SAM-ში ხუთი დამოუკიდებელი ხაზიდან, რომლებიც დეტალურად დავახასიათეთ, ჩვენ შევძელით ფლუორესცენციის შაბლონების ანალიზი, მიღებული pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP კონსტრუქციით (დამატებითი ნახ. 8g–j, l). ამ საკონტროლო ხაზში, მხოლოდ მცირე ცვლილებები ფლუორესცენციის თანაფარდობაში დაფიქსირდა SAM-ში, მაგრამ SAM-ის ცენტრში ჩვენ დავაფიქსირეთ VENUS-ის მკაფიო და მოულოდნელი შემცირება, რომელიც დაკავშირებულია TagBFP-თან. ეს ადასტურებს, რომ qmRGA-ს მიერ დაკვირვებული სასიგნალო ნიმუში ასახავს mRGA-VENUS-ის GA-დამოკიდებულ დეგრადაციას, მაგრამ ასევე აჩვენებს, რომ qmRGA შეიძლება გადაჭარბებული იყოს GA სიგნალის აქტივობა მერისტემის ცენტრში. მოკლედ, ჩვენი შედეგები გამოავლენს GA სიგნალის შაბლონს, რომელიც პირველ რიგში ასახავს პრიმორდიების განაწილებას. ინტერ-პირველადი რეგიონის (IPR) ეს განაწილება განპირობებულია მაღალი GA სასიგნალო აქტივობის თანდათანობით დამკვიდრებით განვითარებად პრიმოდიუმსა და ცენტრალურ რეგიონს შორის, ხოლო ამავე დროს GA სასიგნალო აქტივობა პრიმოდიუმში მცირდება (ნახ. 4c, d).
GID1b და GID1c რეცეპტორების განაწილება (იხ. ზემოთ) ვარაუდობს, რომ GA რეცეპტორების დიფერენციალური გამოხატულება ხელს უწყობს GA სასიგნალო აქტივობის ნიმუშის ფორმირებას SAM-ში. ჩვენ დავინტერესდით, შეიძლება თუ არა ჩართული GA-ს დიფერენციალური დაგროვება. ამ შესაძლებლობის გამოსაკვლევად, ჩვენ გამოვიყენეთ nlsGPS1 GA FRET სენსორი21. გააქტიურების სიხშირე გამოვლინდა nlsGPS1-ის SAM-ში, რომელიც დამუშავებულია 10 μM GA4+7 100 წუთის განმავლობაში (დამატებითი სურ. 9a–e), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ nlsGPS1 პასუხობს GA კონცენტრაციის ცვლილებებს SAM-ში, ისევე როგორც ფესვებში21. nlsGPS1 აქტივაციის სიხშირის სივრცულმა განაწილებამ გამოავლინა შედარებით დაბალი GA დონეები SAM-ის გარე შრეებში, მაგრამ აჩვენა, რომ ისინი ამაღლებული იყო ცენტრში და SAM-ის საზღვრებთან (ნახ. 4e და დამატებითი ნახ. 9a,c). ეს ვარაუდობს, რომ GA ასევე განაწილებულია SAM-ში სივრცითი ნიმუშით, რომელიც შედარებულია qmRGA-ით გამოვლენილთან. როგორც დამატებითი მიდგომა, ჩვენ ასევე განვიხილეთ SAM ფლუორესცენტური GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ან მარტო Fl, როგორც უარყოფითი კონტროლი. Fl სიგნალი განაწილდა მთელ SAM-ზე, ცენტრალურ რეგიონსა და პრიმოდიუმის ჩათვლით, თუმცა უფრო დაბალი ინტენსივობით (ნახ. 4j და დამატებითი ნახ. 10d). ამის საპირისპიროდ, სამივე GA-Fl დაგროვდა სპეციალურად პრიმორდიუმის საზღვრებში და სხვადასხვა ხარისხით დანარჩენ IPR-ში, GA7-Fl გროვდება IPR-ის უდიდეს დომენში (ნახ. 4k და დამატებითი ნახ. 10a,b). ფლუორესცენციის ინტენსივობის რაოდენობრივმა განსაზღვრამ გამოავლინა, რომ IPR არა-IPR ინტენსივობის თანაფარდობა უფრო მაღალი იყო GA-Fl დამუშავებულ SAM-ში, ვიდრე Fl დამუშავებული SAM (ნახ. 4l და დამატებითი ნახ. 10c). ერთად, ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ GA არის უფრო მაღალი კონცენტრაციით IPR უჯრედებში, რომლებიც მდებარეობს ორგანოს საზღვართან ყველაზე ახლოს. ეს ვარაუდობს, რომ SAM GA სასიგნალო აქტივობის ნიმუში გამოწვეულია როგორც GA რეცეპტორების დიფერენციალური ექსპრესიით, ასევე GA-ს დიფერენციალური დაგროვებით IPR უჯრედებში ორგანოს საზღვრებთან ახლოს. ამრიგად, ჩვენმა ანალიზმა გამოავლინა GA სიგნალიზაციის მოულოდნელი სივრცითი-დროითი ნიმუში, დაბალი აქტივობით SAM-ის ცენტრში და პრიმოდიუმში და უფრო მაღალი აქტივობით IPR-ში პერიფერიულ რეგიონში.
დიფერენციალური GA სასიგნალო აქტივობის როლის გასაგებად SAM-ში, ჩვენ გავაანალიზეთ კორელაცია GA სასიგნალო აქტივობას, უჯრედის გაფართოებას და უჯრედის გაყოფას შორის SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ის რეალურ დროში დროული გამოსახულების გამოყენებით. ზრდის რეგულირებაში GA-ს როლის გათვალისწინებით, მოსალოდნელი იყო დადებითი კორელაცია უჯრედის გაფართოების პარამეტრებთან. ამიტომ, ჩვენ ჯერ შევადარეთ GA სასიგნალო აქტივობის რუქები უჯრედის ზედაპირის ზრდის სიჩქარის რუქებთან (როგორც უჯრედის გაფართოების სიძლიერის მახასიათებელი მოცემული უჯრედისთვის და შვილობილი უჯრედებისთვის გაყოფისას) და ზრდის ანიზოტროპიის რუკებს, რომელიც ზომავს უჯრედის გაფართოების მიმართულებას (ასევე გამოიყენება აქ მოცემული უჯრედისთვის და შვილობილი უჯრედებისთვის გაყოფისას; ნახ. 5). SAM უჯრედის ზედაპირის ზრდის ტემპის ჩვენი რუქები შეესაბამება წინა დაკვირვებებს38,39, მინიმალური ზრდის ტემპებით საზღვარზე და მაქსიმალური ზრდის ტემპებით განვითარებად ყვავილებში (ნახ. 5a). ძირითადი კომპონენტის ანალიზმა (PCA) აჩვენა, რომ GA სასიგნალო აქტივობა უარყოფითად იყო დაკავშირებული უჯრედის ზედაპირის ზრდის ინტენსივობასთან (სურათი 5c). ჩვენ ასევე ვაჩვენეთ, რომ ვარიაციის ძირითადი ღერძი, მათ შორის GA სიგნალის შეყვანა და ზრდის ინტენსივობა, იყო ორთოგონალური მიმართულების მიმართ, რომელიც განსაზღვრულია მაღალი CLV3 ექსპრესიით, რაც ადასტურებს უჯრედების გამორიცხვას SAM ცენტრიდან დანარჩენ ანალიზებში. Spearman-ის კორელაციის ანალიზმა დაადასტურა PCA-ს შედეგები (სურათი 5d), რაც მიუთითებს იმაზე, რომ უფრო მაღალი GA სიგნალები IPR-ში არ იწვევდა უჯრედის უფრო მაღალ გაფართოებას. თუმცა, კორელაციური ანალიზმა გამოავლინა მცირე დადებითი კორელაცია GA სასიგნალო აქტივობასა და ზრდის ანიზოტროპიას შორის (სურათი 5c, d), რაც ვარაუდობს, რომ უფრო მაღალი GA სიგნალიზაცია IPR-ში გავლენას ახდენს უჯრედის ზრდის მიმართულებაზე და, შესაძლოა, უჯრედის გაყოფის სიბრტყის პოზიციაზე.
a, b საშუალო ზედაპირის ზრდის (a) და ზრდის ანიზოტროპიის (b) სითბური რუქები SAM-ში საშუალოდ შვიდ დამოუკიდებელ მცენარეზე (გამოიყენება, როგორც უჯრედის გაფართოების სიძლიერისა და მიმართულების პროქსი, შესაბამისად). c PCA ანალიზი მოიცავდა შემდეგ ცვლადებს: GA სიგნალი, ზედაპირის ზრდის ინტენსივობა, ზედაპირის ზრდის ანიზოტროპია და CLV3 გამოხატულება. PCA კომპონენტი 1 ძირითადად უარყოფითად იყო დაკავშირებული ზედაპირის ზრდის ინტენსივობასთან და დადებითად კორელაციაში GA სიგნალთან. PCA კომპონენტი 2 ძირითადად დადებითად იყო დაკავშირებული ზედაპირის ზრდის ანიზოტროპიასთან და უარყოფითად კორელირებული იყო CLV3 ექსპრესიასთან. პროცენტები წარმოადგენს თითოეული კომპონენტის მიერ ახსნილ ცვალებადობას. d Spearman-ის კორელაციის ანალიზი GA სიგნალს, ზედაპირის ზრდის ინტენსივობას და ზედაპირის ზრდის ანიზოტროპიას შორის ქსოვილის შკალაზე CZ-ის გამოკლებით. რიცხვი მარჯვნივ არის Spearman rho მნიშვნელობა ორ ცვლადს შორის. ვარსკვლავი მიუთითებს შემთხვევებზე, როდესაც კორელაცია/უარყოფითი კორელაცია ძალზე მნიშვნელოვანია. e Col-0 SAM L1 უჯრედების 3D ვიზუალიზაცია კონფოკალური მიკროსკოპით. 10 სთ-ზე SAM-ში (მაგრამ არა პრიმორდიუმში) წარმოქმნილი ახალი უჯრედის კედლები შეფერილია მათი კუთხის მნიშვნელობების მიხედვით. ფერის ზოლი ნაჩვენებია ქვედა მარჯვენა კუთხეში. ჩანართი აჩვენებს შესაბამის 3D სურათს 0 სთ-ზე. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. f Box ნაკვეთები აჩვენებს უჯრედების გაყოფის მაჩვენებლებს IPR-ში და არა-IPR Col-0 SAM-ში (n = 10 დამოუკიდებელი მცენარე). ცენტრალური ხაზი აჩვენებს მედიანას, ხოლო ყუთის საზღვრები მიუთითებს 25-ე და 75-ე პროცენტულებზე. ულვაშები მიუთითებს მინიმალურ და მაქსიმალურ მნიშვნელობებზე, რომლებიც განისაზღვრება R პროგრამული უზრუნველყოფით. P მნიშვნელობები მიღებული იყო Welch-ის ორკუდიანი t-ტესტით. g, h სქემატური დიაგრამა, რომელიც გვიჩვენებს (g) როგორ გავზომოთ ახალი უჯრედის კედლის კუთხე (მაჯენტა) რადიალური მიმართულების მიმართ SAM-ის ცენტრიდან (თეთრი წერტილოვანი ხაზი) ​​(განხილულია მხოლოდ მწვავე კუთხის მნიშვნელობები, ე.ი. 0–90°) და (თ) წრეწირის/გვერდითი და რადიალური მიმართულებები მერისტეში. i უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის სიხშირის ჰისტოგრამები SAM-ზე (მუქი ლურჯი), IPR (საშუალო ლურჯი) და არა-IPR (ღია ლურჯი), შესაბამისად. P მნიშვნელობები მიღებულ იქნა ორკუდიანი კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტით. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. j IPR-ის უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის სიხშირის ჰისტოგრამები P3 (ღია მწვანე), P4 (საშუალო მწვანე) და P5 (მუქი მწვანე) გარშემო. P მნიშვნელობები მიღებულ იქნა ორკუდიანი კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტით. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით.
ამიტომ, ანალიზის დროს ახლად წარმოქმნილი უჯრედის კედლების იდენტიფიცირებით (სურ. 5ე) ჩვენ გამოვიკვლიეთ GA სიგნალიზაციასა და უჯრედის გაყოფის აქტივობას შორის კორელაცია. ამ მიდგომამ საშუალება მოგვცა გაგვეზომა უჯრედის გაყოფის სიხშირე და მიმართულება. გასაკვირია, რომ აღმოვაჩინეთ, რომ უჯრედის გაყოფის სიხშირე IPR-სა და SAM-ის დანარჩენ ნაწილში (არა-IPR, სურ. 5ვ) მსგავსი იყო, რაც მიუთითებს, რომ GA სიგნალიზაციის განსხვავებები IPR და არა-IPR უჯრედებს შორის მნიშვნელოვნად არ მოქმედებს უჯრედის გაყოფაზე. ამან და GA სიგნალიზაციასა და ზრდის ანიზოტროპიას შორის დადებითმა კორელაციამ გვაფიქრებინა, შეეძლო თუ არა GA სიგნალიზაციის აქტივობას გავლენა მოეხდინა უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციაზე. ჩვენ გავზომეთ ახალი უჯრედის კედლის ორიენტაცია, როგორც მწვავე კუთხე რადიალურ ღერძთან მიმართებაში, რომელიც აკავშირებს მერისტემის ცენტრსა და ახალი უჯრედის კედლის ცენტრს (სურ. 5e-i) და დავაკვირდით უჯრედების აშკარა ტენდენციას, რომ დაყოფილიყვნენ რადიალურ ღერძთან მიმართებაში 90°-თან ახლოს მდებარე კუთხით, ყველაზე მაღალი სიხშირეები დაფიქსირდა 70–80°-ზე (23.28%) და 80–90°-ზე (22.62%) (სურ. 5e,i), რაც შეესაბამება უჯრედების წრეწირის/განივი მიმართულებით დაყოფას (სურ. 5h). უჯრედის დაყოფის ამ ქცევაში GA სიგნალიზაციის წვლილის შესასწავლად, ჩვენ გავაანალიზეთ უჯრედების დაყოფის პარამეტრები IPR და არა-IPR-ში ცალ-ცალკე (სურ. 5i). ჩვენ დავაკვირდით, რომ IPR უჯრედებში გაყოფის კუთხის განაწილება განსხვავდებოდა არა-IPR უჯრედებში ან მთელი SAM-ის უჯრედებში არსებული განაწილებისგან, სადაც IPR უჯრედები ავლენდნენ ლატერალური/წრიული უჯრედული გაყოფის უფრო მაღალ პროპორციას, ანუ 70–80° და 80–90° (შესაბამისად, 33.86% და 30.71%, შესაბამისი პროპორციები) (სურ. 5i). ამრიგად, ჩვენმა დაკვირვებებმა გამოავლინა კავშირი მაღალ GA სიგნალიზაციასა და უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციას შორის, რომელიც ახლოსაა წრეწირის მიმართულებასთან, მსგავსია GA სიგნალიზაციის აქტივობასა და ზრდის ანიზოტროპიას შორის კორელაციისა (სურ. 5c, d). ამ ასოციაციის სივრცითი კონსერვაციის უკეთ დასადგენად, ჩვენ გავზომეთ გაყოფის სიბრტყის ორიენტაცია პრიმორდიუმს გარშემო არსებულ IPR უჯრედებში P3-დან დაწყებული, რადგან ყველაზე მაღალი GA სიგნალიზაციის აქტივობა დაფიქსირდა ამ რეგიონში P4-დან დაწყებული (სურ. 4). P3-ისა და P4-ის გარშემო IPR-ის გაყოფის კუთხეებმა არ აჩვენა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი განსხვავებები, თუმცა გვერდითი უჯრედული გაყოფის გაზრდილი სიხშირე დაფიქსირდა P4-ის გარშემო IPR-ში (სურ. 5j). თუმცა, P5-ის გარშემო არსებულ IPR უჯრედებში, უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის სხვაობა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი გახდა, განივი უჯრედული გაყოფის სიხშირის მკვეთრი ზრდით (სურ. 5j). ეს შედეგები ერთად მიუთითებს, რომ GA სიგნალიზაციას შეუძლია უჯრედული გაყოფის ორიენტაციის კონტროლი SAM-ში, რაც თანხვედრაშია წინა ანგარიშებთან40,41, რომ მაღალი GA სიგნალიზაციას შეუძლია უჯრედული გაყოფის გვერდითი ორიენტაციის ინდუცირება IPR-ში.
პროგნოზირებულია, რომ IPR-ის უჯრედები არ იქნება ინკორპორირებული პრიმორდიაში, არამედ ინტერკვანძებში2,42,43. IPR-ში უჯრედების დაყოფის განივი ორიენტაცია შეიძლება გამოიწვიოს ეპიდერმული უჯრედების პარალელური გრძივი რიგების ტიპიური ორგანიზება ინტერკვანძებში. ზემოთ აღწერილი ჩვენი დაკვირვებები ვარაუდობს, რომ GA სიგნალი სავარაუდოდ თამაშობს როლს ამ პროცესში უჯრედების გაყოფის მიმართულების რეგულირებით.
რამდენიმე DELLA გენის ფუნქციის დაკარგვა იწვევს GA-ს კონსტიტუციურ პასუხს და დელა მუტანტები შეიძლება გამოყენებულ იქნას ამ ჰიპოთეზის შესამოწმებლად44. ჩვენ პირველად გავაანალიზეთ SAM-ში ხუთი DELLA გენის გამოხატვის ნიმუშები. GUS ხაზის ტრანსკრიპციულმა შერწყმა45 გამოავლინა, რომ GAI, RGA, RGL1 და RGL2 (ბევრად ნაკლებად) გამოხატული იყო SAM-ში (დამატებითი სურ. 11a–d). In situ ჰიბრიდიზაციამ შემდგომში აჩვენა, რომ GAI mRNA გროვდება სპეციალურად პრიმორდიაში და განვითარებად ყვავილებში (დამატებითი სურ. 11e). RGL1 და RGL3 mRNA იყო აღმოჩენილი მთელს SAM კანოპში და ძველ ყვავილებში, ხოლო RGL2 mRNA იყო უფრო უხვი სასაზღვრო რეგიონში (დამატებითი სურ. 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-ის კონფოკალური გამოსახულება დაადასტურა ექსპრესია, რომელიც დაფიქსირდა in situ ჰიბრიდიზაციით და აჩვენა, რომ RGL3 ცილა გროვდება SAM-ის ცენტრალურ ნაწილში (დამატებითი სურ. 11i). pRGA::GFP-RGA ხაზის გამოყენებით, ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ RGA ცილა გროვდება SAM-ში, მაგრამ მისი სიმრავლე მცირდება საზღვარზე დაწყებული P4-დან (დამატებითი სურ. 11j). აღსანიშნავია, რომ RGL3-ისა და RGA-ის გამოხატვის ნიმუშები შეესაბამება უფრო მაღალ GA სასიგნალო აქტივობას IPR-ში, როგორც ეს არის გამოვლენილი qmRGA (ნახ. 4). უფრო მეტიც, ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ ყველა DELLA გამოხატულია SAM-ში და რომ მათი გამოხატულება ერთობლივად მოიცავს მთელ SAM-ს.
ჩვენ შემდეგ გავაანალიზეთ უჯრედის გაყოფის პარამეტრები ველური ტიპის SAM-ში (Ler, კონტროლი) და gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della ხუთმაგი (გლობალური) მუტანტებში (ნახ. 6a, b). საინტერესოა, რომ ჩვენ დავაფიქსირეთ სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი ცვლილება უჯრედების გაყოფის კუთხის სიხშირეების განაწილებაში della global მუტანტის SAM-ში ველურ ტიპთან შედარებით (ნახ. 6c). დელა გლობალური მუტანტის ეს ცვლილება განპირობებული იყო 80-90° კუთხის სიხშირის ზრდით (34,71% 24,55%-ის წინააღმდეგ) და, უფრო მცირე ზომით, 70-80° კუთხით (23,78% vs. 20,18%), ე.ი. შეესაბამება უჯრედების განივი დაყოფას (ნახ. არაგანივი დაყოფის სიხშირე (0-60°) ასევე დაბალი იყო დელა გლობალურ მუტანტში (ნახ. 6c). უჯრედების განივი დაყოფის სიხშირე მნიშვნელოვნად გაიზარდა della გლობალური მუტანტის SAM-ში (ნახ. 6b). უჯრედების განივი დაყოფის სიხშირე IPR-ში ასევე უფრო მაღალი იყო დელა გლობალურ მუტანტში ველურ ტიპთან შედარებით (ნახ. 6d). IPR რეგიონის გარეთ, ველურ ტიპს ჰქონდა უჯრედების გაყოფის კუთხეების უფრო ერთგვაროვანი განაწილება, მაშინ როდესაც დელა გლობალური მუტანტი უპირატესობას ანიჭებდა ტანგენციალურ განყოფილებებს, როგორიცაა IPR (ნახ. 6e). ჩვენ ასევე რაოდენობრივად დავადგინეთ უჯრედების დაყოფის ორიენტაცია ga2 ოქსიდაზას (ga2ox) ხუთმაგი მუტანტის SAM-ში (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 და ga2ox6-2), GA-არააქტიური მუტანტის ფონზე, რომელშიც GA აკუმულირებულია. GA დონის ზრდის შესაბამისად, ხუთმაგი ga2ox მუტანტის ყვავილის SAM უფრო დიდი იყო ვიდრე Col-0 (დამატებითი სურ. 12a, b) და Col-0-თან შედარებით, ხუთმაგი ga2ox SAM აჩვენებდა უჯრედების გაყოფის კუთხეების მკვეთრად განსხვავებულ განაწილებას, 9° სიხშირის კუთხით კვლავ იზრდებოდა 50°-მდე. განყოფილებები (დამატებითი სურ. 12a–c). ამრიგად, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ GA სიგნალის კონსტიტუციური გააქტიურება და GA დაგროვება იწვევს უჯრედების ლატერალურ დაყოფას IPR-ში და დანარჩენ SAM-ში.
a, b PI-შეღებილი Ler (a) და გლობალური დელა მუტანტის (b) SAM-ის L1 ფენის 3D ვიზუალიზაცია კონფოკალური მიკროსკოპის გამოყენებით. ახალი უჯრედის კედლები, რომლებიც წარმოიქმნება SAM-ში (მაგრამ არა პრიმორდიუმში) 10 საათის განმავლობაში, ნაჩვენებია და ფერდება მათი კუთხის მნიშვნელობების მიხედვით. ჩანართი აჩვენებს SAM-ს 0 სთ-ზე. ფერის ზოლი ნაჩვენებია ქვედა მარჯვენა კუთხეში. (b) ისარი მიუთითებს გასწორებული უჯრედული ფაილების მაგალითზე გლობალურ დელა მუტანტში. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. ce შედარება უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციების სიხშირის განაწილების მთელ SAM-ში (d), IPR (e) და არა-IPR (f) ლერსა და გლობალურ დელას შორის. P მნიშვნელობები მიღებულ იქნა ორკუდიანი კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტის გამოყენებით. f, g Col-0 (i) და pCUC2::gai-1-VENUS (j) ტრანსგენური მცენარეების PI-შეღებილი SAM-ის კონფოკალური სურათების 3D ვიზუალიზაცია. პანელები (a, b) აჩვენებენ ახალ უჯრედულ კედლებს (მაგრამ არა პრიმორდიებს), რომლებიც წარმოიქმნება SAM-ში 10 საათის განმავლობაში. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. h–j უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციების სიხშირის განაწილების შედარება მთელ SAM-ში (h), IPR (i) და არა-IPR (j) Col-0 და pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეებს შორის. P მნიშვნელობები მიღებულ იქნა ორკუდიანი კოლმოგოროვი-სმირნოვის ტესტის გამოყენებით.
ჩვენ შემდეგ გამოვცადეთ GA სიგნალის დათრგუნვის ეფექტი კონკრეტულად IPR-ში. ამ მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ კოტილედონის თასის 2 (CUC2) პრომოტორი დომინანტური უარყოფითი gai-1 პროტეინის გამოხატვისთვის, რომელიც შერწყმულია VENUS-თან (pCUC2::gai-1-VENUS ხაზში). ველური ტიპის SAM-ში, CUC2 პრომოტორი ახდენს IPR-ების უმეტესობის ექსპრესიას SAM-ში, მათ შორის სასაზღვრო უჯრედებს, P4-დან მოყოლებული, და მსგავსი სპეციფიკური გამოხატულება დაფიქსირდა pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეებში (იხ. ქვემოთ). უჯრედების გაყოფის კუთხეების განაწილება pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეების SAM ან IPR-ზე მნიშვნელოვნად არ განსხვავდებოდა ველური ტიპის მცენარეებისგან, თუმცა მოულოდნელად აღმოვაჩინეთ, რომ უჯრედები IPR-ის გარეშე ამ მცენარეებში იყოფა უფრო მაღალი სიხშირით 80-90° (ნახ. 6f–j).
ვარაუდობენ, რომ უჯრედების გაყოფის მიმართულება დამოკიდებულია SAM-ის გეომეტრიაზე, კერძოდ, დაჭიმვის სტრესზე, რომელიც წარმოიქმნება ქსოვილის გამრუდებით46. ამიტომ ჩვენ ვკითხეთ, შეიცვალა თუ არა SAM-ის ფორმა დელა გლობალურ მუტანტში და pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეებში. როგორც ადრე იყო მოხსენებული12, დელა გლობალური მუტანტის SAM-ის ზომა უფრო დიდი იყო, ვიდრე ველური ტიპის (დამატებითი სურ. 13a, b, d). CLV3-ისა და STM რნმ-ის in situ ჰიბრიდიზაციამ დაადასტურა მერისტემის გაფართოება დელა მუტანტებში და შემდგომში აჩვენა ღეროვანი უჯრედის ნიშის გვერდითი გაფართოება (დამატებითი სურ. 13e, f, h, i). თუმცა, SAM გამრუდება ორივე გენოტიპში მსგავსი იყო (დამატებითი სურ. 13k, m, n, p). ჩვენ დავაფიქსირეთ ზომის მსგავსი ზრდა gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della ოთხმაგ მუტანტში მრუდის ცვლილების გარეშე ველურ ტიპთან შედარებით (დამატებითი სურ. 13c, d, g, j, l, o, p). უჯრედების გაყოფის ორიენტაციის სიხშირეზე ასევე იმოქმედა დელა ოთხმაგ მუტანტში, მაგრამ უფრო მცირე ზომით, ვიდრე დელა მონოლითურ მუტანტში (დამატებითი სურ. 12d–f). ეს დოზირების ეფექტი, სიმრუდეზე ზემოქმედების ნაკლებობასთან ერთად, ვარაუდობს, რომ ნარჩენი RGL3 აქტივობა Della ოთხმაგ მუტანტში ზღუდავს ცვლილებებს უჯრედის გაყოფის ორიენტაციაში, რომელიც გამოწვეულია DELLA აქტივობის დაკარგვით და რომ უჯრედების გვერდითი დაყოფის ცვლილებები ხდება GA სასიგნალო აქტივობის ცვლილებების საპასუხოდ, ვიდრე SAM გეომეტრიის ცვლილებების საპასუხოდ. როგორც ზემოთ იყო აღწერილი, CUC2 პრომოტორი არეგულირებს IPR გამოხატვას SAM-ში, დაწყებული P4-დან (დამატებითი სურ. 14a, b), და ამის საპირისპიროდ, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ს ჰქონდა შემცირებული ზომა, მაგრამ უფრო მაღალი გამრუდება (დამატებითი სურ. 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM მორფოლოგიაში ამ ცვლილებამ შეიძლება გამოიწვიოს მექანიკური სტრესების განსხვავებული განაწილება ველურ ტიპთან შედარებით, რომელშიც მაღალი წრეწირები იწყება SAM ცენტრიდან უფრო მოკლე მანძილზე47. ალტერნატიულად, ცვლილებები pCUC2::gai-1-VENUS SAM მორფოლოგიაში შეიძლება გამოწვეული იყოს ტრანსგენური ექსპრესიით გამოწვეული რეგიონალური მექანიკური თვისებების ცვლილებებით48. ორივე შემთხვევაში, ამან შეიძლება ნაწილობრივ შეცვალოს GA სიგნალის ცვლილებების ეფექტი გაზრდის ალბათობით, რომ უჯრედები გაიყოფა წრეწირულ/განივი ორიენტაციაში, რაც ხსნის ჩვენს დაკვირვებებს.
ერთად აღებული, ჩვენი მონაცემები ადასტურებს, რომ უმაღლესი GA სიგნალიზაცია აქტიურ როლს თამაშობს IPR-ში უჯრედის გაყოფის სიბრტყის გვერდითი ორიენტაციაში. ისინი ასევე აჩვენებენ, რომ მერისტემის გამრუდება ასევე გავლენას ახდენს უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციაზე IPR-ში.
გაყოფის სიბრტყის განივი ორიენტაცია IPR-ში, მაღალი GA სასიგნალო აქტივობის გამო, ვარაუდობს, რომ GA წინასწარ აწყობს რადიალურ უჯრედულ ფაილს ეპიდერმისში SAM-ში, რათა განისაზღვროს ფიჭური ორგანიზაცია, რომელიც მოგვიანებით მოიძებნება ეპიდერმულ ინტერნოდში. მართლაც, ასეთი უჯრედული ფაილები ხშირად ჩანდა დელა გლობალური მუტანტების SAM სურათებში (ნახ. 6b). ამრიგად, SAM-ში GA სიგნალის სივრცითი ნიმუშის განვითარების ფუნქციის შემდგომი შესასწავლად, ჩვენ გამოვიყენეთ დროითი გამოსახულება IPR-ში უჯრედების სივრცითი ორგანიზაციის გასაანალიზებლად ველური ტიპის (Ler და Col-0), della global მუტანტებში და pCUC2::gai-1-VENUS ტრანსგენურ მცენარეებში.
ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ qmRGA აჩვენა, რომ GA სასიგნალო აქტივობა IPR-ში გაიზარდა P1/P2-დან და მიაღწია პიკს P4-ზე და ეს ნიმუში დროთა განმავლობაში რჩებოდა მუდმივი (ნახ. 4a–f და დამატებითი ნახ. 8c–f, k). IPR-ში უჯრედების სივრცითი ორგანიზაციის გასაანალიზებლად GA სიგნალის გაზრდით, ჩვენ მივანიშნეთ Ler IPR უჯრედები P4-ის ზემოთ და გვერდებზე მათი განვითარების ბედის მიხედვით, რომელიც გაანალიზებულია პირველი დაკვირვებიდან 34 საათის შემდეგ, ანუ ორზე მეტი პლასტიდური დრო, რაც საშუალებას გვაძლევს მივყვეთ IPR უჯრედებს პრიმოდიუმის განვითარების დროს P1/P2-დან P4-მდე. ჩვენ გამოვიყენეთ სამი განსხვავებული ფერი: ყვითელი იმ უჯრედებისთვის, რომლებიც ინტეგრირებული იყო პრიმორდიუმში P4-თან ახლოს, მწვანე მათთვის, ვინც იყო IPR-ში და მეწამული მათთვის, ვინც მონაწილეობდა ორივე პროცესში (ნახ. 7a–c). t0-ზე (0 სთ) P4-ის წინ ჩანდა IPR უჯრედების 1-2 ფენა (ნახ. 7a). როგორც მოსალოდნელი იყო, როდესაც ეს უჯრედები იყოფა, ისინი ამას აკეთებდნენ ძირითადად განივი გაყოფის სიბრტყის მეშვეობით (ნახ. 7a–c). მსგავსი შედეგები იქნა მიღებული Col-0 SAM-ის გამოყენებით (ფოკუსირება P3-ზე, რომლის საზღვარი იკეცება P4-ის მსგავსად ლერში), თუმცა ამ გენოტიპში ყვავილის საზღვარზე წარმოქმნილი ნაოჭი უფრო სწრაფად მალავდა IPR უჯრედებს (ნახ. 7g–i). ამრიგად, IPR უჯრედების გაყოფის ნიმუში წინასწარ აწყობს უჯრედებს რადიალურ რიგებად, როგორც ინტერნოდებში. რადიალური რიგების ორგანიზება და IPR უჯრედების ლოკალიზაცია თანმიმდევრულ ორგანოებს შორის ვარაუდობს, რომ ეს უჯრედები არიან კვანძთაშორისი წინამორბედები.
აქ ჩვენ შევიმუშავეთ რაციომეტრიული GA სასიგნალო ბიოსენსორი, qmRGA, რომელიც საშუალებას იძლევა GA სიგნალის აქტივობის რაოდენობრივი რუკების შედგენა GA და GA რეცეპტორების კომბინირებული კონცენტრაციების შედეგად, ხოლო ენდოგენური სასიგნალო გზების ჩარევის მინიმუმამდე დაყვანა, რაც უზრუნველყოფს ინფორმაციას GA ფუნქციის შესახებ უჯრედულ დონეზე. ამ მიზნით, ჩვენ ავაშენეთ მოდიფიცირებული DELLA ცილა, mRGA, რომელმაც დაკარგა DELLA-ს ურთიერთქმედების პარტნიორებთან შეკავშირების უნარი, მაგრამ რჩება მგრძნობიარე GA-ით გამოწვეული პროტეოლიზის მიმართ. qmRGA რეაგირებს როგორც ეგზოგენურ, ისე ენდოგენურ ცვლილებებზე GA დონეზე და მისი დინამიური სენსორული თვისებები საშუალებას იძლევა შეფასდეს სივრცითი-დროებითი ცვლილებები GA სასიგნალო აქტივობაში განვითარების დროს. qmRGA ასევე ძალიან მოქნილი ინსტრუმენტია, რადგან ის შეიძლება ადაპტირდეს სხვადასხვა ქსოვილებზე მისი გამოხატვისთვის გამოყენებული პრომოტორის შეცვლით (საჭიროების შემთხვევაში), და თუ გავითვალისწინებთ GA სასიგნალო გზის და PFYRE მოტივის კონსერვაციას ანგიოსპერმებში, ის სავარაუდოდ გადავადება სხვა სახეობებზე22. ამის შესაბამისად, ბრინჯის SLR1 DELLA პროტეინის (HYY497AAA) ეკვივალენტური მუტაცია ასევე თრგუნავს SLR1-ის ზრდის რეპრესორის აქტივობას, ხოლო მხოლოდ ოდნავ ამცირებს მის GA შუამავლობით დეგრადაციას, მსგავსი mRGA23. აღსანიშნავია, რომ ბოლო კვლევებმა Arabidopsis-ში აჩვენა, რომ ერთჯერადი ამინომჟავის მუტაცია PFYRE დომენში (S474L) ცვლის RGA-ს ტრანსკრიპციულ აქტივობას ტრანსკრიპციის ფაქტორის პარტნიორებთან ურთიერთქმედების უნარზე ზემოქმედების გარეშე50. მიუხედავად იმისა, რომ ეს მუტაცია ძალიან ახლოს არის mRGA-ში არსებულ 3 ამინომჟავის ჩანაცვლებასთან, ჩვენი კვლევები აჩვენებს, რომ ეს ორი მუტაცია ცვლის DELLA-ს განსხვავებულ მახასიათებლებს. მიუხედავად იმისა, რომ ტრანსკრიფციის ფაქტორის პარტნიორების უმეტესობა უკავშირდება DELLA26,51-ის LHR1 და SAW დომენებს, ზოგიერთი კონსერვირებული ამინომჟავა PFYRE დომენში შეიძლება დაეხმაროს ამ ურთიერთქმედების სტაბილიზაციას.
კვანძების განვითარება მცენარის არქიტექტურისა და მოსავლიანობის გაუმჯობესების მთავარი მახასიათებელია. qmRGA-მ გამოავლინა უფრო მაღალი GA სასიგნალო აქტივობა IPR კვანძთაშორის პროგენიტორ უჯრედებში. რაოდენობრივი ვიზუალიზაციისა და გენეტიკის კომბინაციით, ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ GA სიგნალის შაბლონები აჭარბებს უჯრედების წრიულ/განივი გაყოფის სიბრტყეებს SAM-ის ეპიდერმისში, რაც აყალიბებს უჯრედთა დაყოფის ორგანიზაციას, რომელიც საჭიროა ინტერნოდის განვითარებისთვის. განვითარების პროცესში გამოვლინდა უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის რამდენიმე რეგულატორი52,53. ჩვენი ნამუშევარი იძლევა ნათელ მაგალითს, თუ როგორ არეგულირებს GA სიგნალის აქტივობა ამ ფიჭურ პარამეტრს. DELLA-ს შეუძლია ურთიერთქმედება წინასწარ დასაკეცი ცილოვან კომპლექსებთან41, ამიტომ GA სიგნალი შეიძლება არეგულირებს უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციას უშუალოდ ზემოქმედებით კორტიკალური მიკროტუბულების ორიენტაციაზე40,41,54,55. ჩვენ მოულოდნელად ვაჩვენეთ, რომ SAM-ში, უფრო მაღალი GA სასიგნალო აქტივობის კორელატი იყო არა უჯრედის გახანგრძლივება ან გაყოფა, არამედ მხოლოდ ზრდის ანიზოტროპია, რაც შეესაბამება GA-ს პირდაპირ ეფექტს უჯრედების გაყოფის მიმართულებით IPR-ში. თუმცა, ჩვენ არ შეგვიძლია გამოვრიცხოთ, რომ ეს ეფექტი შეიძლება იყოს არაპირდაპირი, მაგალითად, შუამავალი GA-ის გამოწვეული უჯრედის კედლის დარბილებით56. უჯრედის კედლის თვისებების ცვლილებები იწვევს მექანიკურ სტრესს57,58, რომელსაც ასევე შეუძლია გავლენა მოახდინოს უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციაზე ქერქის მიკროტუბულების ორიენტაციაზე ზემოქმედებით39,46,59. GA-ით გამოწვეული მექანიკური სტრესის და GA-ს მიერ მიკროტუბულების ორიენტაციის პირდაპირი რეგულირების კომბინირებული ეფექტები შეიძლება ჩართული იყოს IPR-ში უჯრედების გაყოფის ორიენტაციის სპეციფიკური ნიმუშის გენერირებაში, რათა განისაზღვროს ინტერკვანძები, და საჭიროა შემდგომი კვლევები ამ იდეის შესამოწმებლად. ანალოგიურად, წინა კვლევებმა ხაზგასმით აღნიშნეს DELLA-თან ურთიერთქმედების პროტეინების TCP14 და 15 მნიშვნელობა კვანძთაშუა ფორმირების კონტროლში60,61 და ამ ფაქტორებმა შეიძლება შუამავლობდნენ GA-ს მოქმედებას BREVIPEDICELLUS (BP) და PENNYWISE (PNY) ერთად, რომლებიც არეგულირებენ კვანძთაშორის განვითარებას და ნაჩვენებია, რომ გავლენას ახდენს GA2 სიგნალზე2. იმის გათვალისწინებით, რომ DELLA-ები ურთიერთქმედებენ ბრასინოსტეროიდთან, ეთილენთან, ჟასმონის მჟავასთან და აბსციზინის მჟავასთან (ABA) სასიგნალო გზებთან63,64 და რომ ამ ჰორმონებს შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ მიკროტუბულურ ორიენტაციაზე65, GA-ს ზემოქმედება უჯრედების გაყოფის ორიენტაციაზე შეიძლება ასევე იყოს შუამავალი სხვა ჰორმონებით.
ადრეულმა ციტოლოგიურმა კვლევებმა აჩვენა, რომ Arabidopsis SAM-ის შიდა და გარე რეგიონები საჭიროა ინტერკვანძების განვითარებისთვის2,42. ის ფაქტი, რომ GA აქტიურად არეგულირებს უჯრედების დაყოფას შიდა ქსოვილებში12, მხარს უჭერს GA-ს ორმაგ ფუნქციას მერისტემისა და კვანძთაშუა ზომის რეგულირებაში SAM-ში. მიმართული უჯრედების გაყოფის ნიმუში ასევე მჭიდროდ არის რეგულირებული შიდა SAM ქსოვილში და ეს რეგულაცია აუცილებელია ღეროს ზრდისთვის52. საინტერესო იქნება იმის გამოკვლევა, თამაშობს თუ არა GA როლს უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტირებაში შიდა SAM ორგანიზაციაში, რითაც სინქრონიზდება SAM-ში ინტერნოდების სპეციფიკაცია და განვითარება.
მცენარეები გაიზარდა in vitro ნიადაგში ან 1x Murashige-Skoog (MS) გარემოში (Duchefa), რომელსაც დაემატა 1% საქაროზა და 1% აგარი (Sigma) სტანდარტულ პირობებში (16 სთ განათება, 22 °C), გარდა ჰიპოკოტილისა და ფესვის ზრდის ექსპერიმენტებისა, რომლებშიც ნერგები გაიზარდა ვერტიკალურ თეფშებზე 22 °C მუდმივ შუქზე. ნიტრატების ექსპერიმენტებისთვის მცენარეები გაიზარდა მოდიფიცირებულ MS გარემოზე (bioWORLD მცენარეული გარემო), რომელსაც დაემატა ადეკვატური ნიტრატი (0 ან 10 მმ KNO3), 0,5 მმ NH4-სუკცინატი, 1% საქაროზა და 1% A-აგარი (სიგმა) ხანგრძლივი დღის პირობებში.
pDONR221-ში ჩასმული GID1a cDNA რეკომბინირებული იყო pDONR P4-P1R-pUBQ10-თან და pDONR P2R-P3-mCherry-თან pB7m34GW-ში pUBQ10::GID1a-mCherry-ის შესაქმნელად. IDD2 დნმ ჩასმული pDONR221-ში იყო რეკომბინირებული pB7RWG266-ში p35S:IDD2-RFP წარმოქმნის მიზნით. pGID1b::2xmTQ2-GID1b გენერირებისთვის, 3.9 კბ ფრაგმენტი GID1b კოდირების რეგიონის ზემოთ და 4.7 კბ ფრაგმენტი, რომელიც შეიცავს GID1b cDNA-ს (1.3 კბ) და ტერმინატორს (3.4 კბ) ჯერ გაძლიერდა პრაიმერების გამოყენებით დამატებით ცხრილში (შემდეგ PRmoR-ში ჩასმული pP4-ში და 3-ში). Fisher Scientific) და pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), შესაბამისად, და საბოლოოდ რეკომბინირებული pDONR221 2xmTQ268-თან pGreen 012567 სამიზნე ვექტორში Gateway კლონირების გამოყენებით. pCUC2:: LSSmOrange-ის გენერირებისთვის, CUC2 პრომოტორული თანმიმდევრობა (3229 bp ATG-ს ზემოთ) მოჰყვა დიდი Stokes-ის გადანაცვლებული mOrange-ის კოდირების თანმიმდევრობა (LSSmOrange)69 N7 ბირთვული ლოკალიზაციის სიგნალით და NOS ტრანსკრიპციული ტერმინატორი G სამიზნე ვეცინის გამოყენებით შეიკრიბა. 3-ფრაგმენტიანი რეკომბინაციის სისტემა (ინვიტროგენი). მცენარეული ორობითი ვექტორი შეყვანილი იქნა Agrobacterium tumefaciens შტამში GV3101 და შეყვანილი იქნა Nicotiana benthamiana ფოთლებში Agrobacterium ინფილტრაციის მეთოდით და Arabidopsis thaliana Col-0-ში, შესაბამისად, ყვავილოვანი ჩაღრმავების მეთოდით. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry და pCLV3::mCherry-NLS qmRGA იზოლირებული იყო შესაბამისი ჯვრების F3 და F1 შთამომავლებიდან, შესაბამისად.
რნმ in situ ჰიბრიდიზაცია ჩატარდა დაახლოებით 1 სმ სიგრძის ყლორტებზე72, რომლებიც შეგროვდა და დაუყოვნებლივ ფიქსირდა FAA ხსნარში (3.7% ფორმალდეჰიდი, 5% ძმარმჟავა, 50% ეთანოლი) წინასწარ გაცივებულ 4 °C-მდე. 2 × 15 წთ ვაკუუმური დამუშავების შემდეგ, ფიქსატორი შეიცვალა და ნიმუშები ინკუბირებული იყო ღამით. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 და RGL3 cDNA და ანტისენსიური ზონდები მათი 3'-UTRs სინთეზირებული იყო პრაიმერების გამოყენებით, რომლებიც ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში 3, როგორც აღწერილია Rosier et al.73-ის მიერ. დიგოქსიგენინზე ეტიკეტირებული ზონდები იმუნოდეტექტირებულ იქნა დიგოქსიგენინის ანტისხეულების გამოყენებით (3000-ჯერადი განზავება; როში, კატალოგის ნომერი: 11 093 274 910) და სექციები შეღებილი იყო 5-ბრომო-4-ქლორო-3-ინდოლილფოსფატით (BCIP, 0,093,274 910). (NBT, 200-ჯერადი განზავების) ხსნარი.