რაოდენობრივი გიბერელინის ბიოსენსორი ავლენს გიბერელინების როლს კვანძთაშორის სპეციფიკაციაში აპიკალური მერისტემის გასროლაში.

ყლორტის აპიკალური მერისტემის (SAM) ზრდა ღეროს არქიტექტურისთვის კრიტიკულად მნიშვნელოვანია. მცენარეული ჰორმონებიგიბერელინები(GA) მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ მცენარის ზრდის კოორდინაციაში, თუმცა მათი როლი SAM-ში ბოლომდე შესწავლილი არ არის. აქ ჩვენ შევიმუშავეთ GA სიგნალიზაციის რაციომეტრიული ბიოსენსორი DELLA ცილის ინჟინერიით, რათა ჩაახშოს მისი არსებითი მარეგულირებელი ფუნქცია GA ტრანსკრიფციულ პასუხში, ამავდროულად შეინარჩუნოს მისი დეგრადაცია GA ამოცნობის შემდეგ. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ეს დეგრადაციაზე დაფუძნებული ბიოსენსორი ზუსტად აღრიცხავს GA დონისა და უჯრედული აღქმის ცვლილებებს განვითარების დროს. ჩვენ გამოვიყენეთ ეს ბიოსენსორი SAM-ში GA სიგნალიზაციის აქტივობის რუკის შესაქმნელად. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ მაღალი GA სიგნალები უპირატესად გვხვდება ორგანოების პრიმორდიებს შორის მდებარე უჯრედებში, რომლებიც წარმოადგენენ ინტერნოდული უჯრედების წინამორბედებს. ფუნქციის მომატებისა და დაკარგვის მიდგომების გამოყენებით, ჩვენ ასევე ვაჩვენებთ, რომ GA არეგულირებს უჯრედის დაყოფის სიბრტყის ორიენტაციას, ადგენს ინტერნოდების კანონიკურ უჯრედულ ორგანიზაციას, რითაც ხელს უწყობს ინტერნოდული სპეციფიკაციას SAM-ში.
ყლორტის აპიკალური მერისტემა (SAM), რომელიც ყლორტის მწვერვალზე მდებარეობს, შეიცავს ღეროვანი უჯრედების ნიშას, რომელთა აქტივობა მცენარის მთელი სიცოცხლის განმავლობაში მოდულური და განმეორებითი გზით წარმოქმნის გვერდით ორგანოებსა და ღეროვან კვანძებს. თითოეული ეს განმეორებადი ერთეული, ანუ მცენარის კვანძი, მოიცავს კვანძებში არსებულ კვანძებს შორის და გვერდით ორგანოებს, ასევე ფოთლების იღლიის მერისტემებს იღლიის მერისტემებში. მცენარის კვანძების ზრდა და ორგანიზაცია განვითარების დროს იცვლება. Arabidopsis-ში ვეგეტატიური სტადიის დროს კვანძთაშორისი ზრდა თრგუნავს და იღლიის მერისტემები როზეტისებრი ფოთლების იღლიებში მიძინებულ მდგომარეობაში რჩება. ყვავილობის ფაზაში გადასვლისას, SAM ყვავილედის მერისტემად იქცევა, რაც წარმოქმნის წაგრძელებულ კვანძებს შორის და იღლიის კვირტებს, ტოტებს ყვავილოვანი ფოთლების იღლიებში და მოგვიანებით, უფოთლო ყვავილებს. მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ მნიშვნელოვანი პროგრესი მივაღწიეთ ფოთლების, ყვავილებისა და ტოტების წარმოქმნის მაკონტროლებელი მექანიზმების გაგებაში, შედარებით ცოტა რამ არის ცნობილი იმის შესახებ, თუ როგორ წარმოიქმნება კვანძები შორის.
GA-ების სივრცე-დროითი განაწილების გაგება ხელს შეუწყობს ამ ჰორმონების ფუნქციების უკეთ გაგებას სხვადასხვა ქსოვილებსა და განვითარების სხვადასხვა ეტაპზე. RGA-GFP შერწყმის დეგრადაციის ვიზუალიზაცია, რომელიც გამოხატულია საკუთარი პრომოტორის მოქმედებით, მნიშვნელოვან ინფორმაციას გვაწვდის ფესვებში GA-ს საერთო დონის რეგულირების შესახებ15,16. თუმცა, RGA-ს ექსპრესია განსხვავდება ქსოვილებში17 და რეგულირდება GA18-ით. ამრიგად, RGA პრომოტორის დიფერენციალურმა ექსპრესიამ შეიძლება გამოიწვიოს RGA-GFP-თან დაკვირვებული ფლუორესცენციის ნიმუში და, შესაბამისად, ეს მეთოდი არ არის რაოდენობრივი. ცოტა ხნის წინ, ბიოაქტიურმა ფლუორესცეინმა (Fl) მონიშნულმა GA19,20-მა გამოავლინა GA-ს დაგროვება ფესვის ენდოკორტექსში და მისი უჯრედული დონის რეგულირება GA ტრანსპორტით. ცოტა ხნის წინ, GA FRET სენსორმა nlsGPS1 აჩვენა, რომ GA-ს დონეები კორელაციაშია უჯრედების დაგრძელებასთან ფესვებში, ძაფებსა და მუქად ამოსულ ჰიპოკოტილებში21. თუმცა, როგორც ვნახეთ, GA კონცენტრაცია არ არის ერთადერთი პარამეტრი, რომელიც აკონტროლებს GA სიგნალიზაციის აქტივობას, რადგან ის დამოკიდებულია რთულ სენსორულ პროცესებზე. აქ, DELLA-სა და GA სიგნალიზაციის გზების შესახებ ჩვენი ცოდნის საფუძველზე, ჩვენ წარმოგიდგენთ GA სიგნალიზაციისთვის დეგრადაციაზე დაფუძნებული რაციომეტრიული ბიოსენსორის შემუშავებასა და დახასიათებას. ამ რაოდენობრივი ბიოსენსორის შესაქმნელად, ჩვენ გამოვიყენეთ მუტანტური GA-მგრძნობიარე RGA, რომელიც შერწყმული იყო ფლუორესცენტურ ცილასთან და ყველგან იყო გამოხატული ქსოვილებში, ასევე GA-ს მიმართ არამგრძნობიარე ფლუორესცენტური ცილა. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ მუტანტური RGA ცილის შერწყმები არ ერევა ენდოგენურ GA სიგნალიზაციას ყველგან ექსპრესირებისას და რომ ამ ბიოსენსორს შეუძლია მაღალი სივრცულ-დროითი გარჩევადობით განსაზღვროს სიგნალიზაციის აქტივობა, რომელიც წარმოიქმნება როგორც GA შეყვანის, ასევე GA სიგნალის დამუშავების შედეგად, სენსორული აპარატის მიერ. ჩვენ გამოვიყენეთ ეს ბიოსენსორი GA სიგნალიზაციის აქტივობის სივრცულ-დროითი განაწილების შესაფასებლად და იმის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, თუ როგორ არეგულირებს GA უჯრედულ ქცევას SAM ეპიდერმისში. ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ GA არეგულირებს ორგანოების პრიმორდიებს შორის მდებარე SAM უჯრედების გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციას, რითაც განსაზღვრავს ინტერნოდის კანონიკურ უჯრედულ ორგანიზაციას.
და ბოლოს, ჩვენ ვიკითხეთ, შეეძლო თუ არა qmRGA-ს ენდოგენური GA დონის ცვლილებების შესახებ ინფორმაციის მიწოდება მზარდი ჰიპოკოტილების გამოყენებით. ჩვენ ადრე ვაჩვენეთ, რომ ნიტრატი ასტიმულირებს ზრდას GA სინთეზის გაზრდით და, თავის მხრივ, DELLA34-ის დეგრადაციით. შესაბამისად, ჩვენ დავაკვირდით, რომ ჰიპოკოტილის სიგრძე pUBQ10::qmRGA ნერგებში, რომლებიც გაზრდილნი არიან ნიტრატის უხვი მარაგის (10 mM NO3−) ქვეშ, მნიშვნელოვნად გრძელი იყო, ვიდრე ნიტრატის დეფიციტის პირობებში გაზრდილ ნერგებში (დამატებითი სურ. 6ა). ზრდის რეაქციის შესაბამისად, GA სიგნალები უფრო მაღალი იყო 10 mM NO3− პირობებში გაზრდილ ნერგებში, ვიდრე ნიტრატის არარსებობის პირობებში გაზრდილ ნერგებში (დამატებითი სურ. 6ბ, გ). ამრიგად, qmRGA ასევე საშუალებას იძლევა GA სიგნალიზაციის ცვლილებების მონიტორინგი, რომლებიც გამოწვეულია GA კონცენტრაციის ენდოგენური ცვლილებებით.
იმის გასაგებად, დამოკიდებულია თუ არა qmRGA-ს მიერ აღმოჩენილი GA სიგნალიზაციის აქტივობა GA კონცენტრაციასა და GA აღქმაზე, როგორც ეს სენსორის დიზაინის მიხედვით იყო მოსალოდნელი, ჩვენ გავაანალიზეთ სამი GID1 რეცეპტორის ექსპრესია ვეგეტატიურ და რეპროდუქციულ ქსოვილებში. ნერგებში, GID1-GUS რეპორტიორულმა ხაზმა აჩვენა, რომ GID1a და c მაღალი ექსპრესიით გამოირჩეოდა კოტილედონებში (სურ. 3a–c). გარდა ამისა, სამივე რეცეპტორი ექსპრესირებული იყო ფოთლებში, გვერდითი ფესვის პრიმორდიაში, ფესვის წვეროებში (გარდა GID1b-ის ფესვის ქუდისა) და სისხლძარღვთა სისტემაში (სურ. 3a–c). ინფლორესცენციის SAM-ში, ჩვენ აღმოვაჩინეთ GUS სიგნალები მხოლოდ GID1b-სა და 1c-სთვის (დამატებითი სურ. 7a–c). In situ ჰიბრიდიზაციამ დაადასტურა ექსპრესიის ეს ნიმუშები და დამატებით აჩვენა, რომ GID1c ერთგვაროვნად იყო გამოხატული დაბალ დონეზე SAM-ში, მაშინ როდესაც GID1b-მ აჩვენა უფრო მაღალი ექსპრესია SAM-ის პერიფერიაზე (დამატებითი სურ. 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ტრანსლაციურმა შერწყმამ ასევე გამოავლინა GID1b ექსპრესიის გრადუირებული დიაპაზონი, SAM-ის ცენტრში დაბალი ან საერთოდ არ ექსპრესიიდან ორგანოების საზღვრებზე მაღალ ექსპრესიამდე (დამატებითი სურ. 7m). ამრიგად, GID1 რეცეპტორები არ არის თანაბრად განაწილებული ქსოვილებში და მათ შიგნით. შემდგომ ექსპერიმენტებში ჩვენ ასევე დავაკვირდით, რომ GID1-ის (pUBQ10::GID1a-mCherry) ზედმეტმა ექსპრესიამ გაზარდა qmRGA-ს მგრძნობელობა ჰიპოკოტილებში გარე GA გამოყენების მიმართ (სურ. 3d, e). ამის საპირისპიროდ, ჰიპოკოტილში qd17mRGA-თი გაზომილი ფლუორესცენცია არამგრძნობიარე იყო GA3 დამუშავების მიმართ (სურ. 3f, g). ორივე ანალიზისთვის, ნერგები დამუშავდა GA-ს მაღალი კონცენტრაციით (100 μM GA3) სენსორის სწრაფი ქცევის შესაფასებლად, სადაც GID1 რეცეპტორთან შეკავშირების უნარი გაძლიერებული ან დაკარგული იყო. ეს შდეგები ერთად ადასტურებს, რომ qmRGA ბიოსენსორი კომბინირებულ ფუნქციას ასრულებს, როგორც GA და GA სენსორი და მიუთითებს, რომ GID1 რეცეპტორის დიფერენციალურ ექსპრესიას შეუძლია მნიშვნელოვნად მოახდინოს სენსორის გამოსხივების კოორდინაციის მოდულირება.
დღეისათვის, GA სიგნალების განაწილება SAM-ში გაურკვეველი რჩება. ამიტომ, ჩვენ გამოვიყენეთ qmRGA-გამომხატველი მცენარეები და pCLV3::mCherry-NLS ღეროვანი უჯრედების რეპორტიორი35, რათა გამოგვეთვალა GA სიგნალური აქტივობის მაღალი გარჩევადობის რაოდენობრივი რუკები, ფოკუსირებით L1 შრეზე (ეპიდერმისი; სურ. 4ა, ბ, იხ. მეთოდები და დამატებითი მეთოდები), რადგან L1 მნიშვნელოვან როლს ასრულებს SAM-ის ზრდის კონტროლში36. აქ, pCLV3::mCherry-NLS ექსპრესიამ უზრუნველყო ფიქსირებული გეომეტრიული საცნობარო წერტილი GA სიგნალური აქტივობის სივრცულ-დროითი განაწილების ანალიზისთვის37. მიუხედავად იმისა, რომ GA მნიშვნელოვნად ითვლება გვერდითი ორგანოების განვითარებისთვის4, ჩვენ დავაკვირდით, რომ GA სიგნალები დაბალი იყო ყვავილოვან პრიმორდიუმში (P) P3 სტადიიდან დაწყებული (სურ. 4ა, ბ), მაშინ როდესაც ახალგაზრდა P1 და P2 პრიმორდიუმებს ჰქონდათ ზომიერი აქტივობა, მსგავსი ცენტრალურ რეგიონში (სურ. 4ა, ბ). უფრო მაღალი GA სიგნალიზაციის აქტივობა დაფიქსირდა ორგანოს პრიმორდიუმის საზღვრებზე, დაწყებული P1/P2-დან (საზღვრის გვერდით) და პიკს მიაღწია P4-ზე, ასევე პრიმორდიუმებს შორის მდებარე პერიფერიული რეგიონის ყველა უჯრედში (სურ. 4ა, ბ და დამატებითი სურ. 8ა, ბ). ეს უფრო მაღალი GA სიგნალიზაციის აქტივობა დაფიქსირდა არა მხოლოდ ეპიდერმისში, არამედ L2 და ზედა L3 ფენებშიც (დამატებითი სურ. 8ბ). qmRGA-ს გამოყენებით SAM-ში აღმოჩენილი GA სიგნალების ნიმუში ასევე უცვლელი დარჩა დროთა განმავლობაში (დამატებითი სურ. 8გ–ფ, კ). მიუხედავად იმისა, რომ qd17mRGA კონსტრუქცია სისტემატურად დაქვეითებული იყო ხუთი დამოუკიდებელი ხაზის T3 მცენარეების SAM-ში, რომლებიც დეტალურად დავახასიათეთ, ჩვენ შევძელით pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP კონსტრუქტით მიღებული ფლუორესცენციის ნიმუშების ანალიზი (დამატებითი სურ. 8გ–ჯ, ლ). ამ საკონტროლო ხაზში, SAM-ში ფლუორესცენციის თანაფარდობის მხოლოდ მცირე ცვლილებები დაფიქსირდა, მაგრამ SAM ცენტრში ჩვენ დავაკვირდით TagBFP-თან ასოცირებულ VENUS-ის მკაფიო და მოულოდნელ შემცირებას. ეს ადასტურებს, რომ qmRGA-ს მიერ დაფიქსირებული სიგნალიზაციის ნიმუში ასახავს mRGA-VENUS-ის GA-დამოკიდებულ დეგრადაციას, მაგრამ ასევე აჩვენებს, რომ qmRGA-მ შეიძლება გადაჭარბებულად შეაფასოს GA სიგნალიზაციის აქტივობა მერისტემის ცენტრში. შეჯამებისთვის, ჩვენი შედეგები ავლენს GA სიგნალიზაციის ნიმუშს, რომელიც ძირითადად ასახავს პრიმორდიების განაწილებას. პრიმორდიუმებს შორის რეგიონის (IPR) ეს განაწილება განპირობებულია განვითარებად პრიმორდიუმსა და ცენტრალურ რეგიონს შორის GA სიგნალიზაციის მაღალი აქტივობის თანდათანობითი დამკვიდრებით, ამავდროულად, პრიმორდიუმში GA სიგნალიზაციის აქტივობა მცირდება (სურ. 4c, d).
GID1b და GID1c რეცეპტორების განაწილება (იხ. ზემოთ) მიუთითებს, რომ GA რეცეპტორების დიფერენციალური ექსპრესია ხელს უწყობს SAM-ში GA სიგნალიზაციის აქტივობის ნიმუშის ფორმირებას. ჩვენ დავინტერესდით, შეიძლება თუ არა GA-ს დიფერენციალური დაგროვება ჩართული იყოს. ამ შესაძლებლობის გამოსაკვლევად, ჩვენ გამოვიყენეთ nlsGPS1 GA FRET სენსორი21. გაზრდილი აქტივაციის სიხშირე დაფიქსირდა nlsGPS1-ის SAM-ში, რომელიც დამუშავებული იყო 10 μM GA4+7-ით 100 წუთის განმავლობაში (დამატებითი სურ. 9a–e), რაც მიუთითებს, რომ nlsGPS1 რეაგირებს SAM-ში GA კონცენტრაციის ცვლილებებზე, ისევე როგორც ფესვებში21. nlsGPS1 აქტივაციის სიხშირის სივრცულმა განაწილებამ აჩვენა შედარებით დაბალი GA დონეები SAM-ის გარე ფენებში, მაგრამ აჩვენა, რომ ისინი მომატებული იყო ცენტრში და SAM-ის საზღვრებზე (სურ. 4e და დამატებითი სურ. 9a,c). ეს მიუთითებს, რომ GA ასევე განაწილებულია SAM-ში სივრცითი ნიმუშით, რომელიც შედარებადია qmRGA-თი გამოვლენილთან. დამატებითი მიდგომის სახით, ჩვენ ასევე დავამუშავეთ SAM ფლუორესცენტული GA-თი (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ან მხოლოდ Fl-ით, როგორც უარყოფითი კონტროლი. Fl სიგნალი გადანაწილდა მთელ SAM-ში, მათ შორის ცენტრალურ რეგიონსა და პრიმორდიუმში, თუმცა უფრო დაბალი ინტენსივობით (სურ. 4j და დამატებითი სურ. 10d). ამის საპირისპიროდ, სამივე GA-Fl დაგროვდა სპეციფიკურად პრიმორდიუმების საზღვრებში და სხვადასხვა ხარისხით IPR-ის დანარჩენ ნაწილში, GA7-Fl დაგროვდა IPR-ის უდიდეს დომენში (სურ. 4k და დამატებითი სურ. 10a,b). ფლუორესცენციის ინტენსივობის რაოდენობრივმა განსაზღვრამ აჩვენა, რომ IPR-ისა და არა-IPR ინტენსივობის თანაფარდობა უფრო მაღალი იყო GA-Fl-ით დამუშავებულ SAM-ში, Fl-ით დამუშავებულ SAM-თან შედარებით (სურ. 4l და დამატებითი სურ. 10c). ერთად აღებული, ეს შედეგები მიუთითებს, რომ GA უფრო მაღალი კონცენტრაციით არის წარმოდგენილი IPR უჯრედებში, რომლებიც ორგანოს საზღვართან ყველაზე ახლოს მდებარეობს. ეს იმაზე მიუთითებს, რომ SAM GA სიგნალიზაციის აქტივობის ნიმუში განპირობებულია როგორც GA რეცეპტორების დიფერენციალური ექსპრესიით, ასევე GA-ს დიფერენციალური დაგროვებით IPR უჯრედებში ორგანოების საზღვრებთან ახლოს. ამრიგად, ჩვენმა ანალიზმა გამოავლინა GA სიგნალიზაციის მოულოდნელი სივრცე-დროითი ნიმუში, SAM-ის ცენტრში და პრიმორდიუმში უფრო დაბალი აქტივობით და IPR-ის პერიფერიულ რეგიონში უფრო მაღალი აქტივობით.
SAM-ში დიფერენციალური GA სიგნალიზაციის აქტივობის როლის გასაგებად, ჩვენ გავაანალიზეთ GA სიგნალიზაციის აქტივობას, უჯრედების გაფართოებასა და უჯრედების დაყოფას შორის კორელაცია SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ის რეალურ დროში დროის შეფერხებული გამოსახულების გამოყენებით. ზრდის რეგულირებაში GA-ს როლის გათვალისწინებით, მოსალოდნელი იყო დადებითი კორელაცია უჯრედების გაფართოების პარამეტრებთან. ამიტომ, ჩვენ თავდაპირველად შევადარეთ GA სიგნალიზაციის აქტივობის რუკები უჯრედის ზედაპირის ზრდის ტემპის რუკებს (როგორც მოცემული უჯრედის და შვილეული უჯრედების გაყოფის დროს უჯრედის გაფართოების სიძლიერის პროქსი) და ზრდის ანიზოტროპიის რუკებს, რომელიც ზომავს უჯრედის გაფართოების მიმართულებას (ასევე გამოიყენება აქ მოცემული უჯრედისთვის და შვილეული უჯრედების გაყოფის დროს; სურ. 5ა,ბ, იხილეთ მეთოდები და დამატებითი მეთოდები). SAM უჯრედის ზედაპირის ზრდის ტემპის ჩვენი რუკები შეესაბამება წინა დაკვირვებებს38,39, მინიმალური ზრდის ტემპით საზღვარზე და მაქსიმალური ზრდის ტემპით განვითარებად ყვავილებში (სურ. 5ა). მთავარი კომპონენტის ანალიზმა (PCA) აჩვენა, რომ GA სიგნალიზაციის აქტივობა უარყოფითად კორელირებული იყო უჯრედის ზედაპირის ზრდის ინტენსივობასთან (სურათი 5გ). ჩვენ ასევე ვაჩვენეთ, რომ ვარიაციის ძირითადი ღერძები, მათ შორის GA სიგნალიზაციის შეყვანა და ზრდის ინტენსივობა, ორთოგონალური იყო მაღალი CLV3 ექსპრესიით განსაზღვრული მიმართულების მიმართ, რაც ადასტურებს უჯრედების გამორიცხვას SAM ცენტრიდან დანარჩენ ანალიზებში. სპირმანის კორელაციის ანალიზმა დაადასტურა PCA შედეგები (სურათი 5დ), რაც მიუთითებს, რომ IPR-ში GA სიგნალების უფრო მაღალი დონე არ იწვევდა უჯრედების უფრო მაღალ გაფართოებას. თუმცა, კორელაციის ანალიზმა გამოავლინა უმნიშვნელო დადებითი კორელაცია GA სიგნალიზაციის აქტივობასა და ზრდის ანიზოტროპიას შორის (სურათი 5გ, დ), რაც მიუთითებს, რომ IPR-ში GA სიგნალიზაციის უფრო მაღალი დონე გავლენას ახდენს უჯრედების ზრდის მიმართულებაზე და შესაძლოა უჯრედის დაყოფის სიბრტყის პოზიციაზე.
a, b SAM-ში საშუალო ზედაპირული ზრდის (a) და ზრდის ანიზოტროპიის (b) სითბური რუკები საშუალოდ შვიდ დამოუკიდებელ მცენარეზე იყო (გამოიყენება, შესაბამისად, უჯრედების გაფართოების სიძლიერისა და მიმართულების პროქსიდებად). c PCA ანალიზი მოიცავდა შემდეგ ცვლადებს: GA სიგნალი, ზედაპირის ზრდის ინტენსივობა, ზედაპირის ზრდის ანიზოტროპია და CLV3 ექსპრესია. PCA კომპონენტი 1 ძირითადად უარყოფითად კორელირებდა ზედაპირის ზრდის ინტენსივობასთან და დადებითად კორელირებდა GA სიგნალთან. PCA კომპონენტი 2 ძირითადად დადებითად კორელირებდა ზედაპირის ზრდის ანიზოტროპიასთან და უარყოფითად კორელირებდა CLV3 ექსპრესიასთან. პროცენტები წარმოადგენს თითოეული კომპონენტით ახსნილ ვარიაციას. d სპირმანის კორელაციის ანალიზი GA სიგნალს, ზედაპირის ზრდის ინტენსივობას და ზედაპირის ზრდის ანიზოტროპიას შორის ქსოვილის მასშტაბით, CZ-ის გამოკლებით. მარჯვნივ მოცემული რიცხვი არის სპირმანის rho მნიშვნელობა ორ ცვლადს შორის. ვარსკვლავი მიუთითებს შემთხვევებზე, როდესაც კორელაცია/უარყოფითი კორელაცია ძალიან მნიშვნელოვანია. e Col-0 SAM L1 უჯრედების 3D ვიზუალიზაცია კონფოკალური მიკროსკოპიით. SAM-ში (მაგრამ არა პრიმორდიუმში) 10 საათის შემდეგ წარმოქმნილი ახალი უჯრედის კედლები შეფერილია მათი კუთხის მნიშვნელობების მიხედვით. ფერის ზოლი ნაჩვენებია ქვედა მარჯვენა კუთხეში. ჩანართი აჩვენებს შესაბამის 3D გამოსახულებას 0 საათის შემდეგ. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. f ჩარჩოს დიაგრამები ასახავს უჯრედების დაყოფის სიჩქარეს IPR და არა-IPR Col-0 SAM-ში (n = 10 დამოუკიდებელი მცენარე). ცენტრალური ხაზი აჩვენებს მედიანას, ხოლო ჩარჩოს საზღვრები მიუთითებს მე-25 და 75-ე პროცენტილებზე. ულვაშები მიუთითებს R პროგრამული უზრუნველყოფით განსაზღვრულ მინიმალურ და მაქსიმალურ მნიშვნელობებს. P მნიშვნელობები მიღებული იქნა ველჩის ორმხრივი t-ტესტით. g, h სქემატური დიაგრამა აჩვენებს (g) თუ როგორ გავზომოთ ახალი უჯრედის კედლის კუთხე (მეწამული) SAM-ის ცენტრიდან რადიალური მიმართულებით (თეთრი წერტილოვანი ხაზი) ​​(განხილულია მხოლოდ მწვავე კუთხის მნიშვნელობები, ანუ 0–90°) და (h) მერისტემის შიგნით წრიული/გვერდითი და რადიალური მიმართულებები. i უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის სიხშირის ჰისტოგრამები SAM-ის (მუქი ლურჯი), IPR-ის (საშუალო ლურჯი) და არა-IPR-ის (ღია ლურჯი) გასწვრივ, შესაბამისად. P მნიშვნელობები მიღებული იქნა ორმხრივი კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტით. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. j IPR-ის უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის სიხშირის ჰისტოგრამები P3-ის (ღია მწვანე), P4-ის (საშუალო მწვანე) და P5-ის (მუქი მწვანე) გარშემო, შესაბამისად. P მნიშვნელობები მიღებული იქნა ორმხრივი კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტით. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით.
ამიტომ, ანალიზის დროს ახლად წარმოქმნილი უჯრედის კედლების იდენტიფიცირებით (სურ. 5ე) ჩვენ გამოვიკვლიეთ GA სიგნალიზაციასა და უჯრედის გაყოფის აქტივობას შორის კორელაცია. ამ მიდგომამ საშუალება მოგვცა გაგვეზომა უჯრედის გაყოფის სიხშირე და მიმართულება. გასაკვირია, რომ აღმოვაჩინეთ, რომ უჯრედის გაყოფის სიხშირე IPR-სა და SAM-ის დანარჩენ ნაწილში (არა-IPR, სურ. 5ვ) მსგავსი იყო, რაც მიუთითებს, რომ GA სიგნალიზაციის განსხვავებები IPR და არა-IPR უჯრედებს შორის მნიშვნელოვნად არ მოქმედებს უჯრედის გაყოფაზე. ამან და GA სიგნალიზაციასა და ზრდის ანიზოტროპიას შორის დადებითმა კორელაციამ გვაფიქრებინა, შეეძლო თუ არა GA სიგნალიზაციის აქტივობას გავლენა მოეხდინა უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციაზე. ჩვენ გავზომეთ ახალი უჯრედის კედლის ორიენტაცია, როგორც მწვავე კუთხე რადიალურ ღერძთან მიმართებაში, რომელიც აკავშირებს მერისტემის ცენტრსა და ახალი უჯრედის კედლის ცენტრს (სურ. 5e-i) და დავაკვირდით უჯრედების აშკარა ტენდენციას, რომ დაყოფილიყვნენ რადიალურ ღერძთან მიმართებაში 90°-თან ახლოს მდებარე კუთხით, ყველაზე მაღალი სიხშირეები დაფიქსირდა 70–80°-ზე (23.28%) და 80–90°-ზე (22.62%) (სურ. 5e,i), რაც შეესაბამება უჯრედების წრეწირის/განივი მიმართულებით დაყოფას (სურ. 5h). უჯრედის დაყოფის ამ ქცევაში GA სიგნალიზაციის წვლილის შესასწავლად, ჩვენ გავაანალიზეთ უჯრედების დაყოფის პარამეტრები IPR და არა-IPR-ში ცალ-ცალკე (სურ. 5i). ჩვენ დავაკვირდით, რომ IPR უჯრედებში გაყოფის კუთხის განაწილება განსხვავდებოდა არა-IPR უჯრედებში ან მთელი SAM-ის უჯრედებში არსებული განაწილებისგან, სადაც IPR უჯრედები ავლენდნენ ლატერალური/წრიული უჯრედული გაყოფის უფრო მაღალ პროპორციას, ანუ 70–80° და 80–90° (შესაბამისად, 33.86% და 30.71%, შესაბამისი პროპორციები) (სურ. 5i). ამრიგად, ჩვენმა დაკვირვებებმა გამოავლინა კავშირი მაღალ GA სიგნალიზაციასა და უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციას შორის, რომელიც ახლოსაა წრეწირის მიმართულებასთან, მსგავსია GA სიგნალიზაციის აქტივობასა და ზრდის ანიზოტროპიას შორის კორელაციისა (სურ. 5c, d). ამ ასოციაციის სივრცითი კონსერვაციის უკეთ დასადგენად, ჩვენ გავზომეთ გაყოფის სიბრტყის ორიენტაცია პრიმორდიუმს გარშემო არსებულ IPR უჯრედებში P3-დან დაწყებული, რადგან ყველაზე მაღალი GA სიგნალიზაციის აქტივობა დაფიქსირდა ამ რეგიონში P4-დან დაწყებული (სურ. 4). P3-ისა და P4-ის გარშემო IPR-ის გაყოფის კუთხეებმა არ აჩვენა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი განსხვავებები, თუმცა გვერდითი უჯრედული გაყოფის გაზრდილი სიხშირე დაფიქსირდა P4-ის გარშემო IPR-ში (სურ. 5j). თუმცა, P5-ის გარშემო არსებულ IPR უჯრედებში, უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის სხვაობა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი გახდა, განივი უჯრედული გაყოფის სიხშირის მკვეთრი ზრდით (სურ. 5j). ეს შედეგები ერთად მიუთითებს, რომ GA სიგნალიზაციას შეუძლია უჯრედული გაყოფის ორიენტაციის კონტროლი SAM-ში, რაც თანხვედრაშია წინა ანგარიშებთან40,41, რომ მაღალი GA სიგნალიზაციას შეუძლია უჯრედული გაყოფის გვერდითი ორიენტაციის ინდუცირება IPR-ში.
ვარაუდობენ, რომ IPR-ში არსებული უჯრედები არ ინტეგრირდება პრიმორდიუმებში, არამედ კვანძთაშორისებში2,42,43. IPR-ში უჯრედული დაყოფის განივი ორიენტაცია შესაძლოა გამოიწვიოს ეპიდერმული უჯრედების პარალელური გრძივი რიგების ტიპური ორგანიზაცია კვანძთაშორისებში. ზემოთ აღწერილი ჩვენი დაკვირვებები მიუთითებს, რომ GA სიგნალიზაცია, სავარაუდოდ, გარკვეულ როლს ასრულებს ამ პროცესში უჯრედების დაყოფის მიმართულების რეგულირებით.
რამდენიმე DELLA გენის ფუნქციის დაკარგვა იწვევს კონსტიტუციურ GA პასუხს და ამ ჰიპოთეზის შესამოწმებლად შეიძლება გამოყენებულ იქნას della მუტანტები44. ჩვენ თავდაპირველად გავაანალიზეთ SAM-ში ხუთი DELLA გენის ექსპრესიის ნიმუშები. GUS ხაზის ტრანსკრიფციულმა შერწყმამ45 აჩვენა, რომ GAI, RGA, RGL1 და RGL2 (გაცილებით ნაკლები ხარისხით) ექსპრესირდებოდა SAM-ში (დამატებითი სურ. 11a–d). In situ ჰიბრიდიზაციამ ასევე აჩვენა, რომ GAI mRNA გროვდება სპეციფიკურად პრიმორდიასა და განვითარებად ყვავილებში (დამატებითი სურ. 11e). RGL1 და RGL3 mRNA აღმოჩენილი იქნა SAM-ის ფოთლის მთელ სიგრძეზე და უფრო ძველ ყვავილებში, მაშინ როდესაც RGL2 mRNA უფრო უხვად იყო სასაზღვრო რეგიონში (დამატებითი სურ. 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-ის კონფოკალურმა გამოსახულებამ დაადასტურა in situ ჰიბრიდიზაციით დაფიქსირებული ექსპრესია და აჩვენა, რომ RGL3 ცილა გროვდება SAM-ის ცენტრალურ ნაწილში (დამატებითი სურ. 11i). pRGA::GFP-RGA ხაზის გამოყენებით, ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ RGA ცილა გროვდება SAM-ში, მაგრამ მისი სიმრავლე მცირდება საზღვარზე P4-დან დაწყებული (დამატებითი სურ. 11j). აღსანიშნავია, რომ RGL3-ის და RGA-ს ექსპრესიის ნიმუშები შეესაბამება IPR-ში GA სიგნალიზაციის მაღალ აქტივობას, როგორც ეს qmRGA-ს მიერ იქნა აღმოჩენილი (სურ. 4). უფრო მეტიც, ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ ყველა DELLA გამოხატულია SAM-ში და რომ მათი ექსპრესია ერთობლივად მოიცავს მთელ SAM-ს.
შემდეგ ჩვენ გავაანალიზეთ უჯრედების დაყოფის პარამეტრები ველური ტიპის SAM-ში (Ler, კონტროლი) და gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della ხუთმაგი (გლობალური) მუტანტებში (სურ. 6ა, ბ). საინტერესოა, რომ della global მუტანტის SAM-ში ჩვენ დავაკვირდით უჯრედების დაყოფის კუთხის სიხშირეების განაწილების სტატისტიკურად მნიშვნელოვან ცვლილებას ველურ ტიპთან შედარებით (სურ. 6გ). della global მუტანტში ეს ცვლილება განპირობებული იყო 80–90° კუთხეების სიხშირის ზრდით (34.71% 24.55%-ის წინააღმდეგ) და, უფრო მცირე ზომით, 70–80° კუთხეებით (23.78% 20.18%-ის წინააღმდეგ), ანუ შეესაბამება განივი უჯრედების დაყოფას (სურ. 6გ). არაგანივი დაყოფის სიხშირე (0–60°) ასევე უფრო დაბალი იყო della global მუტანტში (სურ. 6გ). დელა გლობალური მუტანტის SAM-ში განივი უჯრედების დაყოფის სიხშირე მნიშვნელოვნად გაიზარდა (სურ. 6ბ). IPR-ში განივი უჯრედების დაყოფის სიხშირე ასევე უფრო მაღალი იყო დელა გლობალურ მუტანტში ველურ ტიპთან შედარებით (სურ. 6დ). IPR რეგიონის გარეთ, ველურ ტიპს ჰქონდა უჯრედების დაყოფის კუთხეების უფრო ერთგვაროვანი განაწილება, მაშინ როდესაც დელა გლობალურ მუტანტს ანიჭებდა უპირატესობას ტანგენციალურ დაყოფას, როგორიცაა IPR (სურ. 6ე). ჩვენ ასევე რაოდენობრივად განვსაზღვრეთ უჯრედების დაყოფის ორიენტაცია ga2 ოქსიდაზას (ga2ox) ხუთმაგი მუტანტების (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 და ga2ox6-2) SAM-ში, რომელიც წარმოადგენს GA-არააქტიურ მუტანტურ ფონს, რომელშიც გროვდება GA. GA დონის ზრდასთან შესაბამისობაში, ხუთმაგი ga2ox მუტანტის ყვავილედის SAM უფრო დიდი იყო, ვიდრე Col-0-ის (დამატებითი სურ. 12a, b) და Col-0-თან შედარებით, ხუთმაგი ga2ox SAM-მა აჩვენა უჯრედების დაყოფის კუთხეების მკვეთრად განსხვავებული განაწილება, კუთხის სიხშირე 50°-დან 90°-მდე იზრდებოდა, ანუ კვლავ ემხრობოდა ტანგენციალურ დაყოფას (დამატებითი სურ. 12a–c). ამრიგად, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ GA სიგნალიზაციის კონსტიტუციური აქტივაცია და GA დაგროვება იწვევს უჯრედების ლატერალურ დაყოფას IPR-სა და SAM-ის დანარჩენ ნაწილში.
a, b PI-შეღებილი Ler (a)-სა და გლობალური della მუტანტის (b) SAM-ის L1 ფენის 3D ვიზუალიზაცია კონფოკალური მიკროსკოპიის გამოყენებით. SAM-ში (მაგრამ არა პრიმორდიუმში) 10-საათიანი პერიოდის განმავლობაში წარმოქმნილი ახალი უჯრედის კედლები ნაჩვენებია და შეფერილია მათი კუთხის მნიშვნელობების მიხედვით. ჩანართი აჩვენებს SAM-ს 0 სთ-ზე. ფერის ზოლი ნაჩვენებია ქვედა მარჯვენა კუთხეში. (b)-ში ისარი მიუთითებს გლობალურ della მუტანტში გასწორებული უჯრედული ფაილების მაგალითზე. ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. ce უჯრედების დაყოფის სიბრტყის ორიენტაციების სიხშირის განაწილების შედარება მთელ SAM-ში (d), IPR (e) და არა-IPR (f)-ში Ler-სა და გლობალურ della-ს შორის. P მნიშვნელობები მიღებული იქნა ორმხრივი კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტის გამოყენებით. f, g Col-0 (i) და pCUC2::gai-1-VENUS (j) ტრანსგენური მცენარეების PI-შეღებილი SAM-ის კონფოკალური სურათების 3D ვიზუალიზაცია. პანელები (a, b) აჩვენებს SAM-ში 10 საათის განმავლობაში წარმოქმნილ ახალ უჯრედულ კედლებს (მაგრამ არა პრიმორდიას). ექსპერიმენტი ორჯერ განმეორდა მსგავსი შედეგებით. h–j მთელ SAM-ში (h), IPR (i) და არა-IPR (j) მდებარე უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციების სიხშირის განაწილების შედარება Col-0 და pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეებს შორის. P მნიშვნელობები მიღებული იქნა ორმხრივი კოლმოგოროვ-სმირნოვის ტესტის გამოყენებით.
შემდეგ ჩვენ გამოვცადეთ GA სიგნალიზაციის ინჰიბირების ეფექტი სპეციფიკურად IPR-ში. ამ მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ კოტილდონის ჭიქა 2 (CUC2) პრომოტორი VENUS-თან შერწყმული დომინანტური უარყოფითი gai-1 ცილის ექსპრესიის გასაძლიერებლად (pCUC2::gai-1-VENUS ხაზში). ველური ტიპის SAM-ში, CUC2 პრომოტორი იწვევს SAM-ში IPR-ების უმეტესობის ექსპრესიას, მათ შორის სასაზღვრო უჯრედებს, P4-დან და შემდეგ, და მსგავსი სპეციფიკური ექსპრესია დაფიქსირდა pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეებში (იხილეთ ქვემოთ). უჯრედების დაყოფის კუთხეების განაწილება pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეების SAM-ზე ან IPR-ზე მნიშვნელოვნად არ განსხვავდებოდა ველური ტიპისგან, თუმცა მოულოდნელად აღმოვაჩინეთ, რომ ამ მცენარეებში IPR-ის გარეშე უჯრედები იყოფა უფრო მაღალი სიხშირით, 80–90° (სურ. 6f–j).
ვარაუდობენ, რომ უჯრედის დაყოფის მიმართულება დამოკიდებულია SAM-ის გეომეტრიაზე, კერძოდ, ქსოვილის გამრუდებით წარმოქმნილ დაჭიმვის სტრესზე46. ამიტომ, ჩვენ ვიკითხეთ, შეიცვალა თუ არა SAM-ის ფორმა della global მუტანტ და pCUC2::gai-1-VENUS მცენარეებში. როგორც ადრე იყო ცნობილი12, della global მუტანტი SAM-ის ზომა უფრო დიდი იყო, ვიდრე ველური ტიპის (დამატებითი სურ. 13a, b, d). CLV3-ისა და STM RNA-ს in situ ჰიბრიდიზაციამ დაადასტურა მერისტემის გაფართოება della მუტანტებში და ასევე აჩვენა ღეროვანი უჯრედების ნიშის გვერდითი გაფართოება (დამატებითი სურ. 13e, f, h, i). თუმცა, SAM-ის გამრუდება მსგავსი იყო ორივე გენოტიპში (დამატებითი სურ. 13k, m, n, p). gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della ოთხმაგი მუტანტის ზომის მსგავსი ზრდა დავაკვირდით ველურ ტიპთან შედარებით სიმრუდის ცვლილების გარეშე (დამატებითი სურ. 13c, d, g, j, l, o, p). უჯრედების დაყოფის სიხშირეზე გავლენა იქონია დელა ოთხმაგი მუტანტმაც, მაგრამ უფრო ნაკლები ხარისხით, ვიდრე დელა მონოლითურ მუტანტში (დამატებითი სურ. 12d–f). ეს დოზირების ეფექტი, სიმრუდეზე ზემოქმედების არარსებობასთან ერთად, მიუთითებს, რომ Della ოთხმაგი მუტანტის ნარჩენი RGL3 აქტივობა ზღუდავს უჯრედების დაყოფის ორიენტაციის ცვლილებებს, რაც გამოწვეულია DELLA აქტივობის დაკარგვით და რომ გვერდითი უჯრედების დაყოფის ცვლილებები ხდება GA სიგნალიზაციის აქტივობის ცვლილებების საპასუხოდ და არა SAM გეომეტრიის ცვლილებების საპასუხოდ. როგორც ზემოთ აღინიშნა, CUC2 პრომოუტერი აკონტროლებს IPR ექსპრესიას SAM-ში, დაწყებული P4-დან (დამატებითი სურ. 14a, b) და ამის საპირისპიროდ, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ს ჰქონდა შემცირებული ზომა, მაგრამ უფრო მაღალი სიმრუდე (დამატებითი სურ. 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM მორფოლოგიის ამ ცვლილებამ შესაძლოა გამოიწვიოს მექანიკური სტრესების განსხვავებული განაწილება ველურ ტიპთან შედარებით, რომელშიც მაღალი წრიული სტრესები იწყება SAM ცენტრიდან უფრო მოკლე მანძილზე47. ალტერნატიულად, pCUC2::gai-1-VENUS SAM მორფოლოგიის ცვლილებები შეიძლება გამოწვეული იყოს ტრანსგენის ექსპრესიით გამოწვეული რეგიონალური მექანიკური თვისებების ცვლილებებით48. ორივე შემთხვევაში, ამან შეიძლება ნაწილობრივ კომპენსირება გაუწიოს GA სიგნალიზაციის ცვლილებების ეფექტებს იმის ალბათობის გაზრდით, რომ უჯრედები გაიყოფიან წრიული/განივი ორიენტაციით, რაც ხსნის ჩვენს დაკვირვებებს.
ჩვენი მონაცემები ერთად აღებული ადასტურებს, რომ უფრო მაღალი GA სიგნალიზაცია აქტიურ როლს ასრულებს უჯრედის გაყოფის სიბრტყის გვერდით ორიენტაციაში IPR-ში. ისინი ასევე აჩვენებს, რომ მერისტემის გამრუდება ასევე გავლენას ახდენს უჯრედის გაყოფის სიბრტყის ორიენტაციაზე IPR-ში.
IPR-ში გამყოფი სიბრტყის განივი ორიენტაცია, რომელიც გამოწვეულია GA სიგნალიზაციის მაღალი აქტივობით, მიუთითებს, რომ GA წინასწარ აწყობს რადიალურ უჯრედულ ფაილს ეპიდერმისში SAM-ის ფარგლებში, რათა განსაზღვროს უჯრედული ორგანიზაცია, რომელიც მოგვიანებით ეპიდერმულ ინტერნოდში აღმოჩნდება. მართლაც, ასეთი უჯრედული ფაილები ხშირად ჩანდა della global mutants-ის SAM სურათებში (სურ. 6ბ). ამრიგად, SAM-ში GA სიგნალიზაციის სივრცითი ნიმუშის განვითარების ფუნქციის შემდგომი შესწავლის მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ დროის შენელებული ვიზუალიზაცია, რათა გაანალიზებულიყო უჯრედების სივრცითი ორგანიზაცია IPR-ში ველური ტიპის (Ler და Col-0), della global mutants-ში და pCUC2::gai-1-VENUS ტრანსგენურ მცენარეებში.
ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ qmRGA-მ აჩვენა, რომ GA სიგნალიზაციის აქტივობა IPR-ში გაიზარდა P1/P2-დან და პიკს მიაღწია P4-ზე და ეს ნიმუში დროთა განმავლობაში მუდმივი დარჩა (სურ. 4a–f და დამატებითი სურ. 8c–f, k). GA სიგნალის მატებით IPR-ში უჯრედების სივრცითი ორგანიზაციის გასაანალიზებლად, ჩვენ Ler IPR უჯრედები P4-ის ზემოთ და გვერდებზე მოვანიშნეთ მათი განვითარების ბედის მიხედვით, რომელიც გაანალიზდა პირველი დაკვირვებიდან 34 საათის შემდეგ, ანუ ორზე მეტჯერ პლასტიდში, რაც საშუალებას გვაძლევს თვალყური ადევნოთ IPR უჯრედებს პრიმორდიუმში განვითარების დროს P1/P2-დან P4-მდე. ჩვენ გამოვიყენეთ სამი განსხვავებული ფერი: ყვითელი იმ უჯრედებისთვის, რომლებიც ინტეგრირებული იყო პრიმორდიუმში P4-ის მახლობლად, მწვანე მათთვის, რომლებიც იმყოფებოდნენ IPR-ში და იისფერი მათთვის, რომლებიც მონაწილეობდნენ ორივე პროცესში (სურ. 7a–c). t0-ზე (0 h), P4-ის წინ ჩანდა IPR უჯრედების 1-2 ფენა (სურ. 7a). როგორც მოსალოდნელი იყო, როდესაც ეს უჯრედები გაიყო, ისინი ძირითადად განივი გაყოფის სიბრტყის მეშვეობით მოხდა (სურ. 7a–c). მსგავსი შედეგები მიღებული იქნა Col-0 SAM-ის გამოყენებით (ფოკუსირებულია P3-ზე, რომლის კიდეც Ler-ში P4-ის მსგავსად იკეცება), თუმცა ამ გენოტიპში ყვავილის კიდეზე წარმოქმნილი ნაკეცი უფრო სწრაფად მალავს IPR უჯრედებს (სურ. 7g–i). ამრიგად, IPR უჯრედების დაყოფის ნიმუში წინასწარ აწყობს უჯრედებს რადიალურ რიგებად, როგორც ეს ხდება კვანძთაშორისებში. რადიალური რიგების ორგანიზება და IPR უჯრედების ლოკალიზაცია თანმიმდევრულ ორგანოებს შორის მიუთითებს, რომ ეს უჯრედები კვანძთაშორისი წინამორბედები არიან.
აქ ჩვენ შევიმუშავეთ რაციომეტრიული GA სიგნალიზაციის ბიოსენსორი, qmRGA, რომელიც საშუალებას იძლევა GA-სა და GA რეცეპტორების კომბინირებული კონცენტრაციების შედეგად მიღებული GA სიგნალიზაციის აქტივობის რაოდენობრივი რუკების შედგენის, ენდოგენური სიგნალიზაციის გზებში ჩარევის მინიმიზაციის პარალელურად, რითაც ვიღებთ ინფორმაციას GA ფუნქციის შესახებ უჯრედულ დონეზე. ამ მიზნით, ჩვენ შევქმენით მოდიფიცირებული DELLA ცილა, mRGA, რომელმაც დაკარგა DELLA ურთიერთქმედების პარტნიორებთან დაკავშირების უნარი, მაგრამ მგრძნობიარე რჩება GA-ით გამოწვეული პროტეოლიზის მიმართ. qmRGA რეაგირებს GA დონის როგორც ეგზოგენურ, ასევე ენდოგენურ ცვლილებებზე, ხოლო მისი დინამიური სენსორული თვისებები საშუალებას იძლევა შეფასდეს GA სიგნალიზაციის აქტივობის სივრცულ-დროითი ცვლილებები განვითარების დროს. qmRGA ასევე ძალიან მოქნილი ინსტრუმენტია, რადგან მისი ადაპტაცია შესაძლებელია სხვადასხვა ქსოვილებთან მისი ექსპრესიისთვის გამოყენებული პრომოტერის შეცვლით (საჭიროების შემთხვევაში), და GA სიგნალიზაციის გზის კონსერვატიული ბუნებისა და PFYRE მოტივის გათვალისწინებით ანგიოსპერმებში, სავარაუდოდ, ის სხვა სახეობებზეც გადაიცემა22. ამასთან შესაბამისობაში, ბრინჯის SLR1 DELLA ცილაში (HYY497AAA) ეკვივალენტური მუტაცია ასევე თრგუნავს SLR1-ის ზრდის რეპრესორულ აქტივობას, ამავდროულად მხოლოდ უმნიშვნელოდ ამცირებს მის GA-განპირობებულ დეგრადაციას, mRGA23-ის მსგავსად. აღსანიშნავია, რომ Arabidopsis-ზე ჩატარებულმა ბოლოდროინდელმა კვლევებმა აჩვენა, რომ PFYRE დომენში (S474L) ერთი ამინომჟავის მუტაცია ცვლის RGA-ს ტრანსკრიფციულ აქტივობას ტრანსკრიფციის ფაქტორის პარტნიორებთან ურთიერთქმედების უნარზე გავლენის გარეშე50. მიუხედავად იმისა, რომ ეს მუტაცია ძალიან ახლოსაა mRGA-ში არსებულ 3 ამინომჟავის ჩანაცვლებასთან, ჩვენი კვლევები აჩვენებს, რომ ეს ორი მუტაცია ცვლის DELLA-ს განსხვავებულ მახასიათებლებს. მიუხედავად იმისა, რომ ტრანსკრიფციული ფაქტორის პარტნიორების უმეტესობა უკავშირდება DELLA26-ის LHR1 და SAW დომენებს,51 PFYRE დომენში ზოგიერთი კონსერვირებული ამინომჟავა შეიძლება დაეხმაროს ამ ურთიერთქმედებების სტაბილიზაციას.
ინტერნოდის განვითარება მცენარის არქიტექტურისა და მოსავლიანობის გაუმჯობესების მთავარი მახასიათებელია. qmRGA-მ გამოავლინა GA სიგნალიზაციის უფრო მაღალი აქტივობა IPR ინტერნოდის წინამორბედ უჯრედებში. რაოდენობრივი ვიზუალიზაციისა და გენეტიკის კომბინაციით, ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ GA სიგნალიზაციის ნიმუშები ზედმეტად აკრავს SAM ეპიდერმისში წრიულ/განივი უჯრედული დაყოფის სიბრტყეებს, რაც აყალიბებს ინტერნოდის განვითარებისთვის საჭირო უჯრედული დაყოფის ორგანიზაციას. განვითარების დროს იდენტიფიცირდა უჯრედული დაყოფის სიბრტყის ორიენტაციის რამდენიმე რეგულატორი52,53. ჩვენი ნაშრომი იძლევა ნათელ მაგალითს იმისა, თუ როგორ არეგულირებს GA სიგნალიზაციის აქტივობა ამ უჯრედულ პარამეტრს. DELLA-ს შეუძლია ურთიერთქმედება წინასწარ დაკეცილ ცილოვან კომპლექსებთან41, ამიტომ GA სიგნალიზაციამ შეიძლება დაარეგულიროს უჯრედული დაყოფის სიბრტყის ორიენტაცია კორტიკალური მიკროტუბულების ორიენტაციაზე პირდაპირი ზემოქმედებით40,41,54,55. ჩვენ მოულოდნელად ვაჩვენეთ, რომ SAM-ში, GA სიგნალიზაციის უფრო მაღალი აქტივობის კორელატი არ იყო უჯრედის დაგრძელება ან დაყოფა, არამედ მხოლოდ ზრდის ანიზოტროპია, რაც შეესაბამება GA-ს პირდაპირ ეფექტს IPR-ში უჯრედული დაყოფის მიმართულებაზე. თუმცა, არ შეგვიძლია გამოვრიცხოთ, რომ ეს ეფექტი შეიძლება ირიბიც იყოს, მაგალითად, გამოწვეული იყოს GA-ით გამოწვეული უჯრედის კედლის დარბილებით56. უჯრედის კედლის თვისებების ცვლილებები იწვევს მექანიკურ სტრესს57,58, რომელსაც ასევე შეუძლია გავლენა მოახდინოს უჯრედის დაყოფის სიბრტყის ორიენტაციაზე კორტიკალური მიკრომილაკების ორიენტაციაზე ზემოქმედებით39,46,59. GA-ით გამოწვეული მექანიკური სტრესისა და GA-ს მიერ მიკრომილაკების ორიენტაციის პირდაპირი რეგულირების კომბინირებული ეფექტები შეიძლება მონაწილეობდეს IPR-ში უჯრედის დაყოფის ორიენტაციის სპეციფიკური ნიმუშის გენერირებაში კვანძთაშორისი განსაზღვრის მიზნით და ამ იდეის შესამოწმებლად საჭიროა შემდგომი კვლევები. ანალოგიურად, წინა კვლევებმა ხაზი გაუსვა DELLA-სთან ურთიერთქმედების მქონე ცილებს TCP14 და 15 მნიშვნელობას კვანძთაშორისი ფორმირების კონტროლში60,61 და ეს ფაქტორები შეიძლება იყოს GA-ს მოქმედების შუამავალი BREVIPEDICELLUS (BP) და PENNYWISE (PNY)-თან ერთად, რომლებიც არეგულირებენ კვანძთაშორის განვითარებას და, როგორც ნაჩვენებია, გავლენას ახდენენ GA სიგნალიზაციაზე2,62. იმის გათვალისწინებით, რომ DELLA-ები ურთიერთქმედებენ ბრასინოსტეროიდის, ეთილენის, იასმონის მჟავას და აბსცისის მჟავას (ABA) სასიგნალო გზებთან63,64 და რომ ამ ჰორმონებს შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ მიკროტუბულების ორიენტაციაზე65, GA-ს გავლენა უჯრედების დაყოფის ორიენტაციაზე შეიძლება ასევე განპირობებული იყოს სხვა ჰორმონებით.
ადრეულმა ციტოლოგიურმა კვლევებმა აჩვენა, რომ Arabidopsis SAM-ის როგორც შიდა, ასევე გარე რეგიონები აუცილებელია ინტერნოდული განვითარებისთვის2,42. ის ფაქტი, რომ GA აქტიურად არეგულირებს უჯრედების დაყოფას შიდა ქსოვილებში12, ადასტურებს GA-ს ორმაგ ფუნქციას მერისტემისა და ინტერნოდული ზომის რეგულირებაში SAM-ში. მიმართულებითი უჯრედების დაყოფის ნიმუში ასევე მკაცრად რეგულირდება შიდა SAM ქსოვილში და ეს რეგულაცია აუცილებელია ღეროს ზრდისთვის52. საინტერესო იქნება იმის შესწავლა, თამაშობს თუ არა GA როლს უჯრედების დაყოფის სიბრტყის ორიენტაციაში შიდა SAM ორგანიზაციაში, რითაც სინქრონიზდება ინტერნოდების სპეციფიკაცია და განვითარება SAM-ში.
მცენარეები გაიზარდა in vitro ნიადაგში ან 1x Murashige-Skoog (MS) გარემოში (Duchefa), რომელშიც დამატებული იყო 1% საქაროზა და 1% აგარ (Sigma) სტანდარტულ პირობებში (16 საათიანი განათება, 22 °C), გარდა ჰიპოკოტილისა და ფესვის ზრდის ექსპერიმენტებისა, რომლებშიც ნერგები გაიზარდა ვერტიკალურ ფირფიტებზე მუდმივი განათებისა და 22 °C ტემპერატურის პირობებში. ნიტრატის ექსპერიმენტებისთვის, მცენარეები გაიზარდა მოდიფიცირებულ MS გარემოზე (bioWORLD მცენარეული გარემო), რომელშიც დამატებული იყო საკმარისი რაოდენობის ნიტრატი (0 ან 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-სუქცინატი, 1% საქაროზა და 1% A-აგარი (Sigma) ხანგრძლივი დღის პირობებში.
pDONR221-ში ჩასმული GID1a cDNA რეკომბინირებული იქნა pDONR P4-P1R-pUBQ10-თან და pDONR P2R-P3-mCherry-თან pB7m34GW-ში pUBQ10::GID1a-mCherry-ის გენერირებისთვის. pDONR221-ში ჩასმული IDD2 დნმ რეკომბინირებული იქნა pB7RWG266-ში p35S:IDD2-RFP-ის გენერირებისთვის. pGID1b::2xmTQ2-GID1b-ის გენერირებისთვის, GID1b კოდირების რეგიონის ზემოთ მდებარე 3.9 კბ ფრაგმენტი და GID1b cDNA-ს (1.3 კბ) და ტერმინატორის (3.4 კბ) შემცველი 4.7 კბ ფრაგმენტი თავდაპირველად ამპლიფიცირებული იქნა დამატებით ცხრილში 3 მოცემული პრაიმერების გამოყენებით და შემდეგ შეყვანილი იქნა შესაბამისად pDONR P4-P1R-ში (Thermo Fisher Scientific) და pDONR P2R-P3-ში (Thermo Fisher Scientific), და ბოლოს რეკომბინირებული იქნა pDONR221 2xmTQ268-თან pGreen 012567 სამიზნე ვექტორში Gateway კლონირების გამოყენებით. pCUC2::LSSmOrange-ის გენერირებისთვის, CUC2 პრომოტორის თანმიმდევრობა (ATG-ის ზემოთ 3229 bp), რასაც მოჰყვებოდა დიდი სტოქსისებრი გადახრილი mOrange-ის (LSSmOrange)69 კოდირების თანმიმდევრობა N7 ბირთვული ლოკალიზაციის სიგნალით და NOS ტრანსკრიფციული ტერმინატორით, აწყობილი იქნა pGreen კანამიცინის სამიზნე ვექტორში Gateway 3-ფრაგმენტის რეკომბინაციის სისტემის (Invitrogen) გამოყენებით. მცენარის ბინარული ვექტორი შეყვანილი იქნა Agrobacterium tumefaciens შტამ GV3101-ში და შეყვანილი იქნა Nicotiana benthamiana-ს ფოთლებში Agrobacterium ინფილტრაციის მეთოდით და Arabidopsis thaliana Col-0-ში ფლორისტული დიპ მეთოდით, შესაბამისად. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry და pCLV3::mCherry-NLS qmRGA იზოლირებული იქნა შესაბამისად შესაბამისი შეჯვარებების F3 და F1 შთამომავლებიდან.
რნმ-ის in situ ჰიბრიდიზაცია ჩატარდა დაახლოებით 1 სმ სიგრძის ყლორტების წვერებზე72, რომლებიც შეგროვდა და დაუყოვნებლივ დააფიქსირდა FAA ხსნარში (3.7% ფორმალდეჰიდი, 5% ძმარმჟავა, 50% ეთანოლი), რომელიც წინასწარ იყო გაცივებული 4°C-მდე. 2 × 15 წუთიანი ვაკუუმური დამუშავების შემდეგ, ფიქსატორი შეიცვალა და ნიმუშები ინკუბირებული იქნა მთელი ღამით. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 და RGL3 cDNA-ები და მათი 3′-UTR-ების ანტისენს ზონდები სინთეზირებული იქნა დამატებით ცხრილში 3 მოცემული პრაიმერების გამოყენებით, როგორც აღწერილია როსიერის და სხვების მიერ73. დიგოქსიგენინით მონიშნული ზონდები იმუნოდექტირებული იქნა დიგოქსიგენინის ანტისხეულების გამოყენებით (3000-ჯერადი განზავება; Roche, კატალოგის ნომერი: 11 093 274 910), ხოლო კვეთები შეღებილი იქნა 5-ბრომ-4-ქლორ-3-ინდოლილ ფოსფატის (BCIP, 250-ჯერადი განზავება)/ნიტროლურჯი ტეტრაზოლიუმის (NBT, 200-ჯერადი განზავება) ხსნარით.