ამ კვლევაში, კომბინირებული მკურნალობის მასტიმულირებელი ეფექტებიმცენარეთა ზრდის რეგულატორები*Hypericum perforatum* L.-ში in vitro მორფოგენეზსა და მეორადი მეტაბოლიტების წარმოქმნაზე (2,4-D და კინეტინი) და რკინის ოქსიდის ნანონაწილაკები (Fe₃O₄-NPs) გამოკვლეული იქნა. ოპტიმიზებულმა დამუშავებამ [2,4-D (0.5 მგ/ლ) + კინეტინი (2 მგ/ლ) + Fe₃O₄-NPs (4 მგ/ლ)] მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა მცენარის ზრდის პარამეტრები: მცენარის სიმაღლე გაიზარდა 59.6%-ით, ფესვის სიგრძე 114.0%-ით, კვირტების რაოდენობა 180.0%-ით, ხოლო კოჟრის ახალი წონა 198.3%-ით საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით. ამ კომბინირებულმა დამუშავებამ ასევე გააუმჯობესა რეგენერაციის ეფექტურობა (50.85%) და ჰიპერიცინის შემცველობა 66.6%-ით. GC-MS ანალიზმა გამოავლინა ჰიპეროზიდის, β-პათოლენის და ცეტილის სპირტის მაღალი შემცველობა, რაც პიკის მთლიანი ფართობის 93.36%-ს შეადგენს, ხოლო ფენოლებისა და ფლავონოიდების მთლიანი შემცველობა 80.1%-ით გაიზარდა. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ მცენარეთა ზრდის რეგულატორები (PGR) და Fe₃O₄ ნანონაწილაკები (Fe₃O₄-NPs) ახდენენ სინერგიულ ეფექტს ორგანოგენეზის სტიმულირებით და ბიოაქტიური ნაერთების დაგროვებით, რაც წარმოადგენს სამკურნალო მცენარეების ბიოტექნოლოგიური გაუმჯობესების პერსპექტიულ სტრატეგიას.
კრაზანა (Hypericum perforatum L.), ასევე ცნობილი როგორც კრაზანა, არის მრავალწლიანი ბალახოვანი მცენარე Hypericaceae ოჯახისა, რომელსაც აქვს ეკონომიკური ღირებულება.[1] მისი პოტენციური ბიოაქტიური კომპონენტებია ბუნებრივი ტანინები, ქსანთონები, ფლოროგლუცინოლი, ნაფტალინედიანთრონი (ჰიპერინი და ფსევდოჰიპერინი), ფლავონოიდები, ფენოლური მჟავები და ეთერზეთები.[2,3,4] კრაზანას გამრავლება შესაძლებელია ტრადიციული მეთოდებით; თუმცა, ტრადიციული მეთოდების სეზონურობა, თესლის დაბალი აღმოცენება და დაავადებებისადმი მგრძნობელობა ზღუდავს მის პოტენციალს ფართომასშტაბიანი კულტივაციისა და მეორადი მეტაბოლიტების უწყვეტი ფორმირებისთვის.[1,5,6]
ამგვარად, in vitro ქსოვილოვანი კულტურა მცენარის სწრაფი გამრავლების, გერმპლაზმური რესურსების შენარჩუნებისა და სამკურნალო ნაერთების მოსავლიანობის გაზრდის ეფექტურ მეთოდად ითვლება [7, 8]. მცენარის ზრდის რეგულატორები (PGR) გადამწყვეტ როლს ასრულებენ მორფოგენეზის რეგულირებაში და აუცილებელია კალუსის და მთლიანი ორგანიზმების in vitro კულტივირებისთვის. მათი კონცენტრაციებისა და კომბინაციების ოპტიმიზაცია გადამწყვეტია ამ განვითარების პროცესების წარმატებით დასრულებისთვის [9]. ამიტომ, რეგულატორების შესაბამისი შემადგენლობისა და კონცენტრაციის გაგება მნიშვნელოვანია კრაზანას (H. perforatum) ზრდისა და რეგენერაციული უნარის გასაუმჯობესებლად [10].
რკინის ოქსიდის ნანონაწილაკები (Fe₃O₄) ნანონაწილაკების კლასია, რომლებიც შემუშავებულია ან შემუშავებულია ქსოვილოვანი კულტურისთვის. Fe₃O₄-ს აქვს მნიშვნელოვანი მაგნიტური თვისებები, კარგი ბიოშეთავსებადობა და მცენარის ზრდის ხელშეწყობის და გარემო სტრესის შემცირების უნარი, ამიტომ მან მნიშვნელოვანი ყურადღება მიიპყრო ქსოვილოვანი კულტურის დიზაინში. ამ ნანონაწილაკების პოტენციური გამოყენება შეიძლება მოიცავდეს in vitro კულტურის ოპტიმიზაციას უჯრედების დაყოფის ხელშეწყობის, საკვები ნივთიერებების შეწოვის გაუმჯობესების და ანტიოქსიდანტური ფერმენტების გააქტიურების მიზნით [11].
მიუხედავად იმისა, რომ ნანონაწილაკებმა კარგი მასტიმულირებელი ეფექტი აჩვენეს მცენარის ზრდაზე, *H. perforatum*-ში Fe₃O₄ ნანონაწილაკებისა და ოპტიმიზირებული მცენარის ზრდის რეგულატორების კომბინირებული გამოყენების კვლევები მწირია. ამ ცოდნის ხარვეზის შესავსებად, ამ კვლევამ შეაფასა მათი კომბინირებული ეფექტების გავლენა in vitro მორფოგენეზსა და მეორადი მეტაბოლიტების წარმოებაზე, რათა მიეწოდებინა ახალი ინფორმაცია სამკურნალო მცენარეების მახასიათებლების გასაუმჯობესებლად. ამიტომ, ამ კვლევას ორი მიზანი აქვს: (1) მცენარეთა ზრდის რეგულატორების კონცენტრაციის ოპტიმიზაცია კოჟრის წარმოქმნის, ყლორტების რეგენერაციისა და ფესვიანობის ეფექტურად ხელშესაწყობად in vitro; და (2) Fe₃O₄ ნანონაწილაკების გავლენის შეფასება ზრდის პარამეტრებზე in vitro. სამომავლო გეგმები მოიცავს რეგენერირებული მცენარეების გადარჩენის მაჩვენებლის შეფასებას აკლიმატიზაციის დროს (in vitro). მოსალოდნელია, რომ ამ კვლევის შედეგები მნიშვნელოვნად გააუმჯობესებს *H. perforatum*-ის მიკროგამრავლების ეფექტურობას, რითაც ხელს შეუწყობს ამ მნიშვნელოვანი სამკურნალო მცენარის მდგრად გამოყენებას და ბიოტექნოლოგიურ გამოყენებას.
ამ კვლევაში, ჩვენ მივიღეთ ფოთლების ამონაჭრები მინდორში გაზრდილი ერთწლიანი კრაზანას მცენარეებიდან (დედა მცენარეები). ეს ამონაჭრები გამოყენებული იქნა in vitro კულტურის პირობების ოპტიმიზაციისთვის. კულტივირებამდე, ფოთლები საფუძვლიანად გაირეცხა გამდინარე გამოხდილი წყლის ქვეშ რამდენიმე წუთის განმავლობაში. შემდეგ ამონაჭრების ზედაპირები დეზინფექციას უტარდებოდა 70%-იან ეთანოლში ჩაშვებით 30 წამის განმავლობაში, რასაც მოჰყვა 1.5%-იან ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის (NaOCl) ხსნარში ჩაშვება, რომელიც შეიცავდა Tween 20-ის რამდენიმე წვეთს 10 წუთის განმავლობაში. და ბოლოს, ამონაჭრები სამჯერ გაირეცხა სტერილური გამოხდილი წყლით, სანამ შემდეგ კულტურულ გარემოში გადაიტანდნენ.
მომდევნო ოთხი კვირის განმავლობაში გაიზომა ყლორტების რეგენერაციის პარამეტრები, მათ შორის რეგენერაციის სიჩქარე, ყლორტების რაოდენობა თითოეულ ექსპლანტზე და ყლორტების სიგრძე. როდესაც რეგენერირებული ყლორტები მინიმუმ 2 სმ სიგრძეს აღწევდა, ისინი გადაიტანეს დაფესვიანების საშუალებაში, რომელიც შედგებოდა ნახევრად სიძლიერის MS გარემოსგან, 0.5 მგ/ლ ინდოლბუტირის მჟავასგან (IBA) და 0.3% გუარის ფისისგან. დაფესვიანების კულტურა გაგრძელდა სამი კვირის განმავლობაში, რომლის განმავლობაშიც გაიზომა დაფესვიანების სიჩქარე, ფესვების რაოდენობა და ფესვების სიგრძე. თითოეული დამუშავება განმეორდა სამჯერ, თითოეულ რეპლიკაზე 10 ექსპლანტი კულტივირებული იყო, რაც დაახლოებით 30 ექსპლანტს იძლეოდა თითოეულ დამუშავებაზე.
მცენარის სიმაღლე გაიზომა სანტიმეტრებში (სმ) სახაზავის გამოყენებით, მცენარის ძირიდან ყველაზე მაღალი ფოთლის წვერამდე. ფესვის სიგრძე გაიზომა მილიმეტრებში (მმ) ნერგების ფრთხილად ამოღების და მზარდი საშუალების ამოღებისთანავე. კვირტების რაოდენობა თითოეულ მცენარეზე პირდაპირ დაითვალა. ფოთლებზე შავი ლაქების რაოდენობა, რომლებიც ცნობილია როგორც კვანძები, გაიზომა ვიზუალურად. ითვლება, რომ ეს შავი კვანძები არის ჰიპერიცინის შემცველი ჯირკვლები, ანუ ჟანგვითი ლაქები და გამოიყენება მცენარის დამუშავებაზე რეაქციის ფიზიოლოგიურ ინდიკატორად. მზარდი საშუალების მთელი ამოღების შემდეგ, ნერგების ახალი წონა გაიზომა ელექტრონული სასწორის გამოყენებით მილიგრამის (მგ) სიზუსტით.
კალუსის წარმოქმნის სიჩქარის გამოთვლის მეთოდი შემდეგია: ექსპლანტების ოთხი კვირის განმავლობაში სხვადასხვა ზრდის რეგულატორების (კინაზები, 2,4-D და Fe3O4) შემცველ გარემოში კულტივირების შემდეგ, ითვლება კალუსის წარმოქმნის უნარის მქონე ექსპლანტების რაოდენობა. კალუსის წარმოქმნის სიჩქარის გამოთვლის ფორმულა შემდეგია:
თითოეული დამუშავება სამჯერ განმეორდა, თითოეულ გამეორებაში მინიმუმ 10 ექსპლანტი იქნა გამოკვლეული.
რეგენერაციის სიჩქარე ასახავს კოჟრის ქსოვილის იმ წილს, რომელიც წარმატებით ასრულებს კვირტის დიფერენციაციის პროცესს კოჟრის ფორმირების ეტაპის შემდეგ. ეს მაჩვენებელი აჩვენებს კოჟრის ქსოვილის უნარს, გარდაიქმნას დიფერენცირებულ ქსოვილად და გაიზარდოს მცენარის ახალ ორგანოებად.
დაფესვიანების კოეფიციენტი არის დაფესვიანების უნარის მქონე ტოტების რაოდენობის თანაფარდობა ტოტების საერთო რაოდენობასთან. ეს მაჩვენებელი ასახავს დაფესვიანების ეტაპის წარმატებას, რაც გადამწყვეტია მიკროგამრავლებისა და მცენარის გამრავლებისას, რადგან კარგი დაფესვიანება ხელს უწყობს ნერგების უკეთ გადარჩენას ზრდის პირობებში.
ჰიპერიცინის ნაერთები ექსტრაგირებული იქნა 90%-იანი მეთანოლით. 50 მგ გამხმარი მცენარეული მასალა დაემატა 1 მლ მეთანოლს და 20 წუთის განმავლობაში ულტრაბგერითი საწმენდი საშუალებით (მოდელი A5120-3YJ) ოთახის ტემპერატურაზე, სიბნელეში, 30 კჰც სიხშირით დამუშავებული იქნა ულტრაბგერითი საწმენდით (მოდელი A5120-3YJ). ულტრაბგერითი დამუშავების შემდეგ, ნიმუში დაცენტრიფუგირებული იქნა 6000 ბრ/წთ სიჩქარით 15 წუთის განმავლობაში. შეგროვდა ზედა ფენა და ჰიპერიცინის შთანთქმა გაიზომა 592 ნმ-ზე Plus-3000 S სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით, კონსეისაოს და სხვების მიერ აღწერილი მეთოდის მიხედვით [14].
მცენარის ზრდის რეგულატორებით (PGR) და რკინის ოქსიდის ნანონაწილაკებით (Fe₃O₄-NPs) დამუშავების უმეტესობამ რეგენერირებულ ყლორტებზე შავი კვანძების წარმოქმნა არ გამოიწვია. 0.5 ან 1 მგ/ლ 2,4-D, 0.5 ან 1 მგ/ლ კინეტინით, ან 1, 2 ან 4 მგ/ლ რკინის ოქსიდის ნანონაწილაკებით დამუშავებისას კვანძები არ დაფიქსირებულა. რამდენიმე კომბინაციამ აჩვენა კვანძების განვითარების უმნიშვნელო ზრდა (მაგრამ არა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი) კინეტინის და/ან რკინის ოქსიდის ნანონაწილაკების უფრო მაღალი კონცენტრაციების დროს, როგორიცაა 2,4-D (0.5–2 მგ/ლ) კინეტინთან (1–1.5 მგ/ლ) და რკინის ოქსიდის ნანონაწილაკებთან (2–4 მგ/ლ) კომბინაცია. ეს შედეგები ნაჩვენებია ნახაზ 2-ში. შავი კვანძები წარმოადგენს ჰიპერიცინით მდიდარ ჯირკვლებს, როგორც ბუნებრივად წარმოქმნილ, ასევე სასარგებლო ნივთიერებებს. ამ კვლევაში, შავი კვანძები ძირითადად ასოცირდებოდა ქსოვილების შეყავისფერებასთან, რაც მიუთითებს ჰიპერიცინის დაგროვებისთვის ხელსაყრელ გარემოზე. 2,4-D, კინეტინით და Fe₃O₄ ნანონაწილაკებით დამუშავებამ ხელი შეუწყო კოჟრის ზრდას, შეამცირა შეყავისფრება და გაზარდა ქლოროფილის შემცველობა, რაც მიუთითებს მეტაბოლური ფუნქციის გაუმჯობესებაზე და ჟანგვითი დაზიანების პოტენციურ შემცირებაზე [37]. ამ კვლევაში შეფასდა კინეტინის გავლენა 2,4-D და Fe₃O₄ ნანონაწილაკებთან კომბინაციაში კრაზანას კოჟრის ზრდასა და განვითარებაზე (სურ. 3ა–გ). წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ Fe₃O₄ ნანონაწილაკებს აქვთ სოკოს საწინააღმდეგო და ანტიმიკრობული აქტივობა [38, 39] და, მცენარის ზრდის რეგულატორებთან კომბინაციაში გამოყენებისას, შეუძლიათ მცენარის თავდაცვის მექანიზმების სტიმულირება და უჯრედული სტრესის ინდექსების შემცირება [18]. მიუხედავად იმისა, რომ მეორადი მეტაბოლიტების ბიოსინთეზი გენეტიკურად რეგულირდება, მათი რეალური მოსავლიანობა მნიშვნელოვნად არის დამოკიდებული გარემო პირობებზე. მეტაბოლურ და მორფოლოგიურ ცვლილებებს შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ მეორადი მეტაბოლიტების დონეზე კონკრეტული მცენარეული გენების ექსპრესიის რეგულირებით და გარემო ფაქტორებზე რეაგირებით. გარდა ამისა, ინდუქტორებს შეუძლიათ ახალი გენების გააქტიურების გამოწვევა, რაც თავის მხრივ ასტიმულირებს ფერმენტულ აქტივობას, საბოლოოდ ააქტიურებს მრავალ ბიოსინთეზურ გზას და იწვევს მეორადი მეტაბოლიტების წარმოქმნას. გარდა ამისა, კიდევ ერთმა კვლევამ აჩვენა, რომ დაჩრდილვის შემცირება ზრდის მზის სხივების ზემოქმედებას, რითაც იზრდება დღის ტემპერატურა *Hypericum perforatum*-ის ბუნებრივ ჰაბიტატში, რაც ასევე ხელს უწყობს ჰიპერიცინის მოსავლიანობის ზრდას. ამ მონაცემებზე დაყრდნობით, ამ კვლევამ შეისწავლა რკინის ნანონაწილაკების, როგორც პოტენციური ინდუქტორების როლი ქსოვილოვან კულტურაში. შედეგებმა აჩვენა, რომ ამ ნანონაწილაკებს შეუძლიათ ჰესპერიდინის ბიოსინთეზში ჩართული გენების გააქტიურება ფერმენტული სტიმულაციის გზით, რაც იწვევს ამ ნაერთის დაგროვების ზრდას (სურ. 2). ამიტომ, ბუნებრივ პირობებში მზარდ მცენარეებთან შედარებით, შეიძლება ითქვას, რომ ასეთი ნაერთების წარმოება in vivo ასევე შეიძლება გაძლიერდეს, როდესაც ზომიერი სტრესი შერწყმულია მეორადი მეტაბოლიტების ბიოსინთეზში ჩართული გენების გააქტიურებასთან. კომბინირებული მკურნალობა, როგორც წესი, დადებით გავლენას ახდენს რეგენერაციის სიჩქარეზე, მაგრამ ზოგიერთ შემთხვევაში ეს ეფექტი შესუსტებულია. აღსანიშნავია, რომ 1 მგ/ლ 2,4-D-ით, 1.5 მგ/ლ კინაზათი და სხვადასხვა კონცენტრაციით მკურნალობამ შეიძლება დამოუკიდებლად და მნიშვნელოვნად გაზარდოს რეგენერაციის სიჩქარე 50.85%-ით საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურ. 4გ). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ნანოჰორმონების სპეციფიკურ კომბინაციებს შეუძლიათ სინერგიულად იმოქმედონ მცენარის ზრდისა და მეტაბოლიტების წარმოების ხელშეწყობის მიზნით, რაც დიდი მნიშვნელობისაა სამკურნალო მცენარეების ქსოვილოვანი კულტურისთვის. პალმერმა და კელერმა [50] აჩვენეს, რომ 2,4-D დამუშავებას შეუძლია დამოუკიდებლად გამოიწვიოს კალუსის წარმოქმნა St. perforatum-ში, ხოლო კინაზას დამატებამ მნიშვნელოვნად გააძლიერა კალუსის წარმოქმნა და რეგენერაცია. ეს ეფექტი განპირობებული იყო ჰორმონალური ბალანსის გაუმჯობესებით და უჯრედების დაყოფის სტიმულირებით. ბალმა და სხვებმა [51] აღმოაჩინეს, რომ Fe₃O₄-NP დამუშავებას შეუძლია დამოუკიდებლად გააძლიეროს ანტიოქსიდანტური ფერმენტების ფუნქცია, რითაც ხელს უწყობს ფესვების ზრდას St. perforatum-ში. Fe₃O₄ ნანონაწილაკების შემცველმა კულტურულმა გარემომ 0.5 მგ/ლ, 1 მგ/ლ და 1.5 მგ/ლ კონცენტრაციით გააუმჯობესა სელის მცენარეების რეგენერაციის სიჩქარე [52]. კინეტინის, 2,4-დიქლორბენზოთიაზოლინონის და Fe₃O₄ ნანონაწილაკების გამოყენებამ მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა კოჟრისა და ფესვის წარმოქმნის სიჩქარე, თუმცა, გასათვალისწინებელია ამ ჰორმონების in vitro რეგენერაციისთვის გამოყენების პოტენციური გვერდითი მოვლენები. მაგალითად, 2,4-დიქლორბენზოთიაზოლინონის ან კინეტინის ხანგრძლივმა ან მაღალი კონცენტრაციის გამოყენებამ შეიძლება გამოიწვიოს სომატური კლონური ვარიაცია, ჟანგვითი სტრესი, კოჟრის ანომალიური მორფოლოგია ან ვიტრიფიკაცია. ამიტომ, რეგენერაციის მაღალი სიჩქარე სულაც არ ნიშნავს გენეტიკურ სტაბილურობას. ყველა რეგენერირებული მცენარე უნდა შეფასდეს მოლეკულური მარკერების (მაგ. RAPD, ISSR, AFLP) ან ციტოგენეტიკური ანალიზის გამოყენებით, რათა დადგინდეს მათი ერთგვაროვნება და მსგავსება in vivo მცენარეებთან [53,54,55].
ამ კვლევამ პირველად აჩვენა, რომ მცენარის ზრდის რეგულატორების (2,4-D და კინეტინი) Fe₃O₄ ნანონაწილაკებთან ერთად გამოყენებამ შეიძლება გააძლიეროს მორფოგენეზი და ძირითადი ბიოაქტიური მეტაბოლიტების (მათ შორის ჰიპერიცინის და ჰიპეროზიდის) დაგროვება *Hypericum perforatum*-ში. ოპტიმიზებულმა დამუშავების რეჟიმმა (1 მგ/ლ 2,4-D + 1 მგ/ლ კინეტინი + 4 მგ/ლ Fe₃O₄-NPs) არა მხოლოდ მაქსიმალურად გაზარდა კოჟრის წარმოქმნა, ორგანოგენეზი და მეორადი მეტაბოლიტების მოსავლიანობა, არამედ აჩვენა მსუბუქი ინდუცირების ეფექტი, რაც პოტენციურად აუმჯობესებს მცენარის სტრესისადმი ტოლერანტობას და სამკურნალო ღირებულებას. ნანოტექნოლოგიისა და მცენარეული ქსოვილების კულტურის კომბინაცია უზრუნველყოფს მდგრად და ეფექტურ პლატფორმას სამკურნალო ნაერთების ფართომასშტაბიანი in vitro წარმოებისთვის. ეს შედეგები გზას უხსნის სამრეწველო გამოყენებას და მოლეკულური მექანიზმების, დოზირების ოპტიმიზაციისა და გენეტიკური სიზუსტის სამომავლო კვლევებს, რითაც აკავშირებს სამკურნალო მცენარეების ფუნდამენტურ კვლევას პრაქტიკულ ბიოტექნოლოგიასთან.
გამოქვეყნების დრო: 2025 წლის 12 დეკემბერი