ანტიჰელმინთური პრეპარატი N,N-დიეთილ-m-ტოლუამიდი (DEET) ცნობილია, რომ აინჰიბირებს AChE-ს (აცეტილქოლინესტერაზას) და აქვს პოტენციურად კანცეროგენული თვისებები ჭარბი ვასკულარიზაციის გამო. ამ ნაშრომში ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ DEET სპეციფიკურად ასტიმულირებს ენდოთელურ უჯრედებს, რომლებიც ხელს უწყობენ ანგიოგენეზს, რითაც ზრდიან სიმსივნის ზრდას. DEET ააქტიურებს უჯრედულ პროცესებს, რომლებიც იწვევს ანგიოგენეზს, მათ შორის პროლიფერაციას, მიგრაციას და ადჰეზიას. ეს დაკავშირებულია NO-ს წარმოების და VEGF ექსპრესიის ზრდასთან ენდოთელურ უჯრედებში. M3-ის გაჩუმება ან ფარმაკოლოგიური M3 ინჰიბიტორების გამოყენება აქრობს ყველა ამ ეფექტს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ DEET-ით გამოწვეული ანგიოგენეზი მგრძნობიარეა M3-ის მიმართ. ექსპერიმენტები, რომლებიც ეხება კალციუმის სიგნალიზაციას ენდოთელურ და HEK უჯრედებში, რომლებიც ჭარბად გამოხატავენ M3 რეცეპტორებს, ასევე შეკავშირებისა და დოკინგის კვლევები, მიუთითებს, რომ DEET მოქმედებს როგორც M3 რეცეპტორების ალოსტერული მოდულატორი. გარდა ამისა, DEET აინჰიბირებს AChE-ს, რითაც ზრდის აცეტილქოლინის ბიოშეღწევადობას და მის შეკავშირებას M3 რეცეპტორებთან და აძლიერებს პროანგიოგენურ ეფექტებს ალოსტერული რეგულირების გზით.
პირველადი უჯრედები (EC) იზოლირებული იქნა შვეიცარიელი თაგვების აორტიდან. ექსტრაქციის მეთოდი ადაპტირებული იყო კობაიაშის პროტოკოლიდან 26. თაგვის EC-ები კულტივირებული იყო EBM-2 გარემოში, რომელიც გამდიდრებული იყო 5%-იანი თერმულად ინაქტივირებული FBS-ით მეოთხე პასაჟამდე.
DEET-ის ორი კონცენტრაციის გავლენა HUVEC-ის, U87MG-ის ან BF16F10-ის პროლიფერაციაზე გაანალიზდა CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit-ის (Molecular Probes, C7026) გამოყენებით. მოკლედ, 5.103 უჯრედი თითო ჭაში დაითესა 96 ჭიანჭლიან ფირფიტაში, მიმაგრების საშუალება მიეცა მთელი ღამით და შემდეგ დამუშავდა DEET-ით 24 საათის განმავლობაში. ზრდის გარემოს ამოღების შემდეგ, მიკროფირფიტის თითოეულ ჭაში დაამატეთ საღებავის შემაკავშირებელი ხსნარი და უჯრედები ინკუბირებული იქნა 37°C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში. ფლუორესცენციის დონეები განისაზღვრა Mithras LB940 მულტიმოდური მიკროფირფიტების წამკითხველის (Berthold Technologies, Bad Wildbad, გერმანია) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო 485 ნმ აგზნების ფილტრებით და 530 ნმ ემისიის ფილტრებით.
HUVEC-ები დაითესა 96-ჭეჭიან ფირფიტებში 104 უჯრედის სიმკვრივით თითო ჭაში. უჯრედები დამუშავდა DEET-ით 24 საათის განმავლობაში. უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა შეფასდა კოლორიმეტრიული MTT ანალიზის გამოყენებით (Sigma-Aldrich, M5655). ოპტიკური სიმკვრივის მნიშვნელობები მიღებული იქნა მულტიმოდური მიკროფირფიტების წამკითხველზე (Mithras LB940) 570 ნმ ტალღის სიგრძეზე.
DEET-ის ეფექტები შესწავლილი იქნა in vitro ანგიოგენეზის ანალიზების გამოყენებით. 10-8 M ან 10-5 M DEET-ით დამუშავებამ გაზარდა კაპილარების სიგრძის ფორმირება HUVEC-ებში (სურ. 1ა, ბ, თეთრი ზოლები). საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, 10-14-დან 10-5 M-მდე DEET კონცენტრაციით დამუშავებამ აჩვენა, რომ კაპილარების სიგრძემ მიაღწია პლატოს 10-8 M DEET-ზე (დამატებითი სურ. S2). 10-8 M და 10-5 M კონცენტრაციის დიაპაზონში DEET-ით დამუშავებული HUVEC-ების in vitro პროანგიოგენურ ეფექტში მნიშვნელოვანი განსხვავება არ დაფიქსირებულა.
DEET-ის ნეოვასკულარიზაციაზე ზემოქმედების დასადგენად, ჩვენ ჩავატარეთ ნეოვასკულარიზაციის in vivo კვლევები. 14 დღის შემდეგ, თაგვებს, რომლებსაც ენდოთელური უჯრედები წინასწარ კულტივირებული ჰქონდათ 10-8 M ან 10-5 M DEET-ით, ჰემოგლობინის შემცველობის მნიშვნელოვანი ზრდა აღენიშნებოდათ (სურ. 1გ, თეთრი ზოლები).
გარდა ამისა, DEET-ით გამოწვეული ნეოვასკულარიზაცია შესწავლილი იქნა U87MG ქსენოტრანსპლანტატის მატარებელ თაგვებში, რომლებსაც ყოველდღიურად (ip) უკეთებდნენ DEET-ს ინექციას დოზით, რომელიც, როგორც ცნობილია, იწვევს 10-5 M პლაზმურ კონცენტრაციას, რაც ნორმალურია ექსპოზიციის მქონე ადამიანებში. 23 შემთხვევაში. U87MG უჯრედების თაგვებში ინექციიდან 14 დღის შემდეგ დაფიქსირდა გამოვლენილი სიმსივნეები (ანუ სიმსივნეები >100 მმ3). 28-ე დღეს, სიმსივნის ზრდა მნიშვნელოვნად გაძლიერდა DEET-ით დამუშავებულ თაგვებში საკონტროლო თაგვებთან შედარებით (სურ. 1d, კვადრატები). გარდა ამისა, სიმსივნეების CD31 შეღებვამ აჩვენა, რომ DEET მნიშვნელოვნად ზრდიდა კაპილარების ფართობს, მაგრამ არა მიკროსისხლძარღვების სიმკვრივეს. (სურ. 1e–g).
DETA-თი ინდუცირებულ პროლიფერაციაში მუსკარინული რეცეპტორების როლის დასადგენად გამოყენებული იქნა 10-8 M ან 10-5 M DETA pFHHSiD-ის (10-7 M, M3 რეცეპტორის სელექციური ანტაგონისტი) თანაობისას. HUVEC-ის დამუშავება. pFHHSiD-მ სრულად დაბლოკა DETA-ს პროლიფერაციული თვისებები ყველა კონცენტრაციაზე (ცხრილი 1).
ამ პირობებში, ჩვენ ასევე შევისწავლეთ, გაზრდიდა თუ არა DEET კაპილარების სიგრძეს HUVEC უჯრედებში. ანალოგიურად, pFHHSiD მნიშვნელოვნად უშლიდა ხელს DEET-ით ინდუცირებულ კაპილარების სიგრძეს (სურ. 1ა, ბ, ნაცრისფერი ზოლები). გარდა ამისა, მსგავსი ექსპერიმენტები ჩატარდა M3 siRNA-თი. მიუხედავად იმისა, რომ საკონტროლო siRNA არ იყო ეფექტური კაპილარების წარმოქმნის ხელშეწყობაში, M3 მუსკარინული რეცეპტორის გაჩუმებამ გააუქმა DEET-ის უნარი, გაზარდოს კაპილარების სიგრძე (სურ. 1ა, ბ, შავი ზოლები).
გარდა ამისა, როგორც 10-8 M ან 10-5 M DEET-ით გამოწვეული ვასკულარიზაცია in vitro, ასევე ნეოვასკულარიზაცია in vivo სრულად დაბლოკილი იყო pFHHSiD-ით (სურ. 1c, d, წრეები). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ DEET ხელს უწყობს ანგიოგენეზს სელექციური M3 რეცეპტორების ანტაგონისტების ან M3 siRNA-ს მიმართ მგრძნობიარე გზით.
AChE DEET-ის მოლეკულური სამიზნეა. ისეთ პრეპარატებს, როგორიცაა დონეპეზილი, რომლებიც AChE ინჰიბიტორების ფუნქციას ასრულებენ, შეუძლიათ ენდოთელური ანგიოგენეზის სტიმულირება in vitro და თაგვის უკანა კიდურის იშემიის მოდელებში14. ჩვენ გამოვცადეთ DEET-ის ორი კონცენტრაციის გავლენა AChE ფერმენტის აქტივობაზე HUVEC-ში. DEET-ის დაბალი (10-8 M) და მაღალი (10-5 M) კონცენტრაციები ამცირებდა ენდოთელური AChE აქტივობას საკონტროლო პირობებთან შედარებით (სურ. 2).
DEET-ის ორივე კონცენტრაციამ (10-8 M და 10-5 M) შეამცირა აცეტილქოლინესტერაზას აქტივობა HUVEC-ზე. BW284c51 (10-5 M) გამოყენებული იქნა აცეტილქოლინესტერაზას ინჰიბიტორების კონტროლისთვის. შედეგები გამოხატულია AChE აქტივობის პროცენტულად HUVEC-ზე, რომელიც დამუშავებულია DEET-ის ორი კონცენტრაციით, მატრიცით დამუშავებულ უჯრედებთან შედარებით. მნიშვნელობები გამოხატულია ექვსი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტის საშუალო ± SEM-ის სახით. *p < 0.05 კონტროლთან შედარებით (კრუსკალ-უოლისის და დანის მრავალჯერადი შედარებითი ტესტი).
აზოტის ოქსიდი (NO) მონაწილეობს ანგიოგენურ პროცესში 33, შესაბამისად, შესწავლილი იქნა NO-ს წარმოება DEET-სტიმულირებულ HUVEC-ებში. DEET-ით დამუშავებული ენდოთელური NO-ს წარმოება გაიზარდა საკონტროლო უჯრედებთან შედარებით, მაგრამ მნიშვნელოვან მნიშვნელობას მიაღწია მხოლოდ 10-8 M დოზით (სურ. 3გ). DEET-ით ინდუცირებული NO-ს წარმოების მარეგულირებელი მოლეკულური ცვლილებების დასადგენად, eNOS-ის ექსპრესია და აქტივაცია გაანალიზდა Western blotting-ის მეთოდით. მიუხედავად იმისა, რომ DEET-ით მკურნალობამ არ შეცვალა eNOS-ის ექსპრესია, მან მნიშვნელოვნად გაზარდა eNOS-ის ფოსფორილირება მის გააქტიურების ადგილას (Ser-1177), ამავდროულად შეამცირა მისი ინჰიბიტორული ადგილი (Thr-495) eNOS ფოსფორილირების დროს დაუმუშავებელ უჯრედებთან შედარებით (სურ. 3დ). გარდა ამისა, ფოსფორილირებული eNOS-ის თანაფარდობა აქტივაციის ადგილას და ინჰიბიტორულ ადგილას გამოითვალა ფოსფორილირებული eNOS-ის რაოდენობის ფერმენტის მთლიან რაოდენობასთან ნორმალიზაციის შემდეგ. ეს თანაფარდობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა HUVEC-ებში, რომლებიც დამუშავებულნი იყვნენ DEET-ის თითოეული კონცენტრაციით, დაუმუშავებელ უჯრედებთან შედარებით (სურ. 3დ).
და ბოლოს, VEGF-ის, ერთ-ერთი მთავარი პროანგიოგენური ფაქტორის, ექსპრესია გაანალიზდა Western blotting-ის მეთოდით. DEET-მა მნიშვნელოვნად გაზარდა VEGF-ის ექსპრესია, მაშინ როდესაც pFHHSiD-მ მთლიანად დაბლოკა ეს ექსპრესია.
ვინაიდან DEET-ის ეფექტები მგრძნობიარეა როგორც ფარმაკოლოგიური ბლოკადის, ასევე M3 რეცეპტორების დაქვეითების მიმართ, ჩვენ გამოვცადეთ ჰიპოთეზა, რომ DEET-მა შესაძლოა გააძლიეროს კალციუმის სიგნალიზაცია. გასაკვირია, რომ DEET-მა ვერ გაზარდა ციტოპლაზმური კალციუმი HUVEC-ში (მონაცემები არ არის ნაჩვენები) და HEK/M3-ში (სურ. 4ა, ბ) ორივე გამოყენებული კონცენტრაციისთვის.
გამოქვეყნების დრო: 2024 წლის 30 დეკემბერი