ანტიჰელმინთური პრეპარატი N,N-დიეთილ-მ-ტოლუამიდი (DEET) ცნობილია, რომ აინჰიბირებს AChE-ს (აცეტილქოლინესტერაზა) და აქვს პოტენციური კანცეროგენული თვისებები გადაჭარბებული ვასკულარიზაციის გამო. ამ ნაშრომში ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ DEET სპეციალურად ასტიმულირებს ენდოთელურ უჯრედებს, რომლებიც ხელს უწყობენ ანგიოგენეზს, რითაც ზრდის სიმსივნის ზრდას. DEET ააქტიურებს ანგიოგენეზამდე მიმავალ უჯრედულ პროცესებს, მათ შორის პროლიფერაციას, მიგრაციას და ადჰეზიას. ეს დაკავშირებულია გაზრდილ NO გამომუშავებასთან და VEGF ექსპრესიასთან ენდოთელიალურ უჯრედებში. M3-ის გაჩუმებამ ან ფარმაკოლოგიური M3 ინჰიბიტორების გამოყენებამ გააუქმა ყველა ეს ეფექტი, რაც ვარაუდობს, რომ DEET ინდუცირებული ანგიოგენეზი M3-სადმი მგრძნობიარეა. ექსპერიმენტები, რომლებიც მოიცავს კალციუმის სიგნალიზაციას ენდოთელიურ და HEK უჯრედებში, რომლებიც ჭარბად გამოხატავენ M3 რეცეპტორებს, ისევე როგორც შეკავშირების და შეერთების კვლევები, მიუთითებს, რომ DEET მოქმედებს როგორც M3 რეცეპტორების ალოსტერული მოდულატორი. გარდა ამისა, DEET აინჰიბირებს AChE-ს, რითაც ზრდის აცეტილქოლინის ბიოშეღწევადობას და მის დაკავშირებას M3 რეცეპტორებთან და აძლიერებს პროანგიოგენურ ეფექტებს ალოსტერიული რეგულაციის საშუალებით.
პირველადი EC-ები იზოლირებული იყო შვეიცარიული თაგვების აორტიდან. მოპოვების მეთოდი ადაპტირებული იყო კობაიაშის პროტოკოლიდან 26 . თაგვის EC-ები კულტივირებული იყო EBM-2 გარემოში, რომელსაც დაემატა 5% სითბოს ინაქტივირებული FBS მეოთხე გავლამდე.
DEET-ის ორი კონცენტრაციის ეფექტი HUVEC, U87MG ან BF16F10-ის გამრავლებაზე გაანალიზებული იყო CyQUANT უჯრედების პროლიფერაციის ანალიზის ნაკრების გამოყენებით (მოლეკულური ზონდები, C7026). მოკლედ, 5.103 უჯრედი თითო ჭაბურღილზე დათესეს 96 ჭაბურღილიან თეფშზე, დაუშვეს ღამით და შემდეგ დამუშავდა DEET-ით 24 საათის განმავლობაში. ზრდის საშუალების ამოღების შემდეგ, დაამატეთ საღებავის დამაკავშირებელი ხსნარი მიკროფირფიტის თითოეულ ჭაბურღილში და ჩაატარეთ უჯრედების ინკუბაცია 37 °C ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში. ფლუორესცენციის დონეები განისაზღვრა Mithras LB940 მულტიმოდური მიკროფირფიტის წამკითხველის (Berthold Technologies, Bad Wildbad, გერმანია) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილია 485 ნმ აგზნების ფილტრებით და 530 ნმ ემისიის ფილტრებით.
HUVEC დათესეს 96 ჭაბურღილიან ფირფიტებში 104 უჯრედის სიმკვრივით თითო ჭაბურღილზე. უჯრედები დამუშავდა DEET-ით 24 საათის განმავლობაში. უჯრედის სიცოცხლისუნარიანობა შეფასდა კოლორიმეტრული MTT ანალიზის გამოყენებით (Sigma-Aldrich, M5655). ოპტიკური სიმკვრივის მნიშვნელობები მიღებულ იქნა მრავალმოდურ მიკროფირფიტის წამკითხველზე (Mithras LB940) ტალღის სიგრძეზე 570 ნმ.
DEET-ის ეფექტები შესწავლილი იყო ინ ვიტრო ანგიოგენეზის ანალიზების გამოყენებით. 10-8 M ან 10-5 M DEET მკურნალობამ გაზარდა კაპილარების სიგრძის ფორმირება HUVEC-ებში (ნახ. 1a, b, თეთრი ზოლები). საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, მკურნალობა DEET კონცენტრაციით 10-14-დან 10-5 M-მდე აჩვენა, რომ კაპილარების სიგრძე მიაღწია პლატოს 10-8 M DEET-ზე (დამატებითი სურ. S2). მნიშვნელოვანი განსხვავება არ იქნა ნაპოვნი HUVEC-ების in vitro პროანგიოგენურ ეფექტში, რომლებიც მკურნალობდნენ DEET-ით კონცენტრაციის დიაპაზონში 10-8 M და 10-5 M.
ნეოვასკულარიზაციაზე DEET-ის ეფექტის დასადგენად, ჩვენ ჩავატარეთ in vivo ნეოვასკულარიზაციის კვლევები. 14 დღის შემდეგ, თაგვებმა, რომლებსაც გაუკეთეს ენდოთელური უჯრედები, წინასწარ კულტურულები 10-8 M ან 10-5 M DEET, აჩვენებდნენ ჰემოგლობინის შემცველობის მნიშვნელოვან ზრდას (ნახ. 1c, თეთრი ზოლები).
გარდა ამისა, DEET-ით გამოწვეული ნეოვასკულარიზაცია შესწავლილი იყო U87MG ქსენოტრანსპლანტატით თაგვებში, რომლებსაც ყოველდღიურად (ip) უსვამდნენ DEET დოზით, რომელიც ცნობილია, რომ იწვევს 10-5 M კონცენტრაციას პლაზმაში, რაც ნორმალურია ექსპოზიციის მქონე ადამიანებში. 23-ში. აღმოჩენილი სიმსივნეები (ანუ სიმსივნე >100 მმ3) დაფიქსირდა თაგვებში U87MG უჯრედების ინექციის შემდეგ 14 დღის შემდეგ. 28 დღეს სიმსივნის ზრდა მნიშვნელოვნად გაძლიერდა DEET-ით ნამკურნალევ თაგვებში საკონტროლო თაგვებთან შედარებით (ნახ. 1d, კვადრატები). გარდა ამისა, სიმსივნეების CD31 შეღებვამ აჩვენა, რომ DEET მნიშვნელოვნად ზრდიდა კაპილარების ფართობს, მაგრამ არა მიკროსისხლძარღვების სიმკვრივეს. (ნახ. 1ე–გ).
მუსკარინული რეცეპტორების როლის დასადგენად DETA-ით ინდუცირებულ პროლიფერაციაში გამოყენებული იყო 10-8 M ან 10-5 M DETA pFHHSiD-ის (10-7 M, M3 რეცეპტორის შერჩევითი ანტაგონისტი) თანდასწრებით. HUVEC-ის მკურნალობა. pFHHSiD მთლიანად ბლოკავს DETA-ს პროლიფერაციულ თვისებებს ყველა კონცენტრაციაზე (ცხრილი 1).
ამ პირობებში, ჩვენ ასევე გამოვიკვლიეთ, გაზრდის თუ არა DEET კაპილარების სიგრძეს HUVEC უჯრედებში. ანალოგიურად, pFHHSiD მნიშვნელოვნად აღკვეთა DEET-ით გამოწვეული კაპილარების სიგრძე (ნახ. 1a, b, ნაცრისფერი ზოლები). გარდა ამისა, მსგავსი ექსპერიმენტები ჩატარდა M3 siRNA-თ. მიუხედავად იმისა, რომ საკონტროლო siRNA არ იყო ეფექტური კაპილარების წარმოქმნის ხელშეწყობაში, M3 მუსკარინული რეცეპტორის გაჩუმებამ გააუქმა DEET-ის უნარი გაზარდოს კაპილარების სიგრძე (ნახ. 1a, b, შავი ზოლები).
გარდა ამისა, ორივე 10-8 M ან 10-5 M DEET-ით გამოწვეული ვასკულარიზაცია in vitro და ნეოვასკულარიზაცია in vivo მთლიანად დაბლოკილი იყო pFHHSiD-ით (ნახ. 1c, d, წრეები). ეს შედეგები მიუთითებს, რომ DEET ხელს უწყობს ანგიოგენეზს M3 რეცეპტორის შერჩევითი ანტაგონისტების ან M3 siRNA მიმართ მგრძნობიარე გზის მეშვეობით.
AChE არის DEET-ის მოლეკულური სამიზნე. მედიკამენტებს, როგორიცაა დონეპეზილი, რომლებიც მოქმედებენ როგორც AChE ინჰიბიტორები, შეუძლიათ EC ანგიოგენეზის სტიმულირება in vitro და თაგვის უკანა კიდურის იშემიის მოდელებში14. ჩვენ გამოვცადეთ DEET-ის ორი კონცენტრაციის ეფექტი AChE ფერმენტის აქტივობაზე HUVEC-ში. DEET-ის დაბალი (10-8 მ) და მაღალი (10-5 მ) კონცენტრაცია ამცირებს ენდოთელური AChE აქტივობას საკონტროლო პირობებთან შედარებით (ნახ. 2).
DEET-ის ორივე კონცენტრაცია (10-8 M და 10-5 M) ამცირებს აცეტილქოლინესტერაზას აქტივობას HUVEC-ზე. BW284c51 (10-5 მ) გამოიყენებოდა აცეტილქოლინესთერაზას ინჰიბიტორების საკონტროლოდ. შედეგები გამოხატულია AChE აქტივობის პროცენტულად HUVEC-ზე დამუშავებული DEET-ის ორი კონცენტრაციით, ავტომობილით დამუშავებულ უჯრედებთან შედარებით. მნიშვნელობები გამოიხატება, როგორც ექვსი დამოუკიდებელი ექსპერიმენტის საშუალო ± SEM. *p <0.05 კონტროლთან შედარებით (კრუსკალ-უოლისის და დანის მრავალჯერადი შედარების ტესტი).
აზოტის ოქსიდი (NO) ჩართულია ანგიოგენურ პროცესში 33, შესაბამისად, შესწავლილი იყო NO გამომუშავება DEET-სტიმულირებულ HUVEC-ებში. DEET-ით დამუშავებული ენდოთელური NO გამომუშავება გაიზარდა საკონტროლო უჯრედებთან შედარებით, მაგრამ მიაღწია მნიშვნელობას მხოლოდ 10-8 მ დოზით (ნახ. 3c). მოლეკულური ცვლილებების დასადგენად, რომლებიც აკონტროლებენ DEET-ით გამოწვეული NO-ს წარმოებას, eNOS-ის გამოხატულება და აქტივაცია გაანალიზდა Western blotting-ით. მიუხედავად იმისა, რომ DEET მკურნალობამ არ შეცვალა eNOS-ის ექსპრესია, მან მნიშვნელოვნად გაზარდა eNOS ფოსფორილირება მის გააქტიურებულ ადგილზე (Ser-1177), ხოლო შეამცირა მისი ინჰიბიტორული ადგილი (Thr-495) eNOS ფოსფორილირების არანამკურნალევ უჯრედებთან შედარებით (ნახ. 3d). გარდა ამისა, ფოსფორილირებული eNOS-ის თანაფარდობა აქტივაციის ადგილზე და ინჰიბიტორულ ადგილას გამოითვალა ფოსფორილირებული eNOS-ის ოდენობის ნორმალიზების შემდეგ ფერმენტის მთლიან რაოდენობასთან. ეს თანაფარდობა მნიშვნელოვნად გაიზარდა HUVEC-ებში, რომლებსაც მკურნალობდნენ DEET-ის თითოეული კონცენტრაციით, არანამკურნალევ უჯრედებთან შედარებით (ნახ. 3d).
საბოლოოდ, VEGF-ის გამოხატულება, ერთ-ერთი მთავარი პროანგიოგენური ფაქტორი, გაანალიზდა Western blotting-ით. DEET-მა მნიშვნელოვნად გაზარდა VEGF გამოხატულება, ხოლო pFHHSiD მთლიანად დაბლოკა ეს გამოხატულება.
ვინაიდან DEET-ის ეფექტები მგრძნობიარეა როგორც ფარმაკოლოგიური ბლოკადის, ასევე M3 რეცეპტორების დაქვეითების მიმართ, ჩვენ გამოვცადეთ ჰიპოთეზა, რომ DEET შეიძლება გააძლიეროს კალციუმის სიგნალიზაცია. გასაკვირია, რომ DEET-მა ვერ გაზარდა ციტოპლაზმური კალციუმი HUVEC-ში (მონაცემები არ არის ნაჩვენები) და HEK/M3 (ნახ. 4a, b) ორივე გამოყენებული კონცენტრაციისთვის.
გამოქვეყნების დრო: დეკ-30-2024